摘要
研究背景： Graves病(GD)又称弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进(甲亢)或毒性弥漫性甲状腺肿，是一种常见的自身免疫性疾病(AITD)。本病的发病机制至今尚未完全阐明，然而大量研究已表明，免疫和遗传机制在GD的发病中起着重要的作用。 树突状细胞(DCs)作为体内最有效的抗原呈递细胞，在免疫反应中处于核心调控地位。研究表明，人类外周血DCs主要分为髓系(myeloiddendriticcell；MDC)和浆细胞系(plasmacytoiddendriticcell；PDC)两个亚群，其中MDC分泌IL-12引起Th1免疫应答，而PDC主要引起Th2的免疫应答，但也能通过分泌IFN-α引起Th1免疫应答。有关外周血DC及其亚群与SLE、重症肌无力、哮喘等自身免疫性疾病关系的研究多有报道，然而鲜有对GD研究的相关报道。本研究旨在观察GD患者外周血细胞中DCs亚群数量和功能的变化，寻找优势DC亚群，并以此为切入点，阐明DC在GD致病机制中的作用及途径，为寻找GD免疫干预治疗的靶点以达到病因根治提供理论基础和实验依据。 GD又是一种复杂的多基因疾病，发病受遗传和环境因素的共同影响。目前研究多基因疾病的主要方法是单核苷酸多态性(SNP)病例-对照研究和人群研究。有研究表明，编码IL-16基因启动子区-295位点单核苷酸多态性与多种自身免疫病发病的易感性有关；而近年的研究亦表明，IL-16作为CD4+T细胞的趋化因子参与GD的病理过程，但有关该编码基因单核苷酸多态性对GD发病影响的研究尚未见报道。 本研究拟分析该己知位点和GD发病的关系，并通过对标签SNP(TagSNP)基因型分析，探讨基因多态性的单倍型与GD发病的关系。 研究方法： 收集GD患者(n=36)及性别和年龄匹配的健康志愿者(n=21)的静脉血，利用流式细胞仪分析外周血树突状细胞及其亚群(PDC和MDC)的频数和在PBMC中的比例；利用磁珠分选技术从外周血单个核细胞中分离出MDC(BDCA-1)、PDC(BDCA-4)和健康志愿者的naiveT细胞，并进行混合淋巴细胞培养，观察GD未治疗患者外周血DC亚群刺激naiveT细胞的增殖和分化情况。同时检测上述研究对象及GD治疗组患者(n=32)血清Th1/Th2细胞因子(IFN-γ/IL-4)的水平，评价疾病不同时期血清Th1/Th2细胞因子的变化情况，及DC亚群和血清Th1/Th2细胞因子变化之间的关系。 利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法分析了258例GD患者(其中136例伴GD相关眼病)和208例性别年龄匹配的健康志愿者的IL-16编码基因tagSNP的基因型和单倍型；分析其与GD及其相关眼病发病易感性的关系。 研究结果： 外周血树突状细胞的频数分析显示，初发GD患者体内DC亚群(MDC/PDc)出现偏移，表现为PDC增多(0.25±0.18vs0.11±0.07％，p=0.002；4.50±3.52vs2.74±2.06个/ul,p=0.018)，MDC/PDC的比值下降(3.50±2.22vs4.92±2.85，p=0.042)。体外功能研究显示，GD患者的PDC诱导naiveT细胞向Th1分化的能力较健康对照者显著增强。检测混合淋巴细胞培养反应上清液细胞因子的结果显示，GD患者PDC组分泌的IFN-α、TNF-α、IL-6均显著高于健康对照组(p＜0.05)，提示PDC不仅能通过分泌IFN-α诱导Th1免疫应答，IFN-α还能协同IL-6诱导B细胞向分泌特异性抗体的浆细胞分化，从而促进自身抗体TRAb(TSH受体抗体)的产生。 利用ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ和IL-4的结果显示：GD未治疗组的IFN-γ(61.25±41.49pg/ml)水平显著高于GD治疗组和健康对照组(26.22±11.173pg/mland20.216±16.49pg/ml；p＜0.01)，而GD治疗组的IL-4水平(45.37±39.28pg/ml)则高于GD未治疗组和健康对照组(35.84±13.33pg/ml和34.218±9.33pg/ml；p＜0.05)，提示Th1介导的免疫应答在GD发病初期起重要作用。 对258例GD患者(136例伴GD眼病)和208例健康志愿者DNA的IL-16编码基因tagSNP的基因型和单倍型检测，以及IL-16基因单核苷酸多态性与GD发病易感性关联分析的结果表明，基因型rs4778889TT和rs1131445TT是GD发病的易感因素；而rs4778889TT和rs4778641TT则是GD相关眼病的易感因素。单倍型rs4778889C-rs113445T-rs4778641C对于GD及其相关眼病而言是一个保护因素。 结论： 本研究通过分析初发GD患者外周血树突状细胞及其亚群(PDC和MDC)的频数和在PBMC中的比例，以及体外观察PDC和MDC刺激naiveT细胞增殖和分化的情况，初步探讨了树突状细胞亚群在GD发病机制中的作用和途径。 结果表明： (1)GD患者外周血PDC增多并通过分泌IFN-α促使naiveT细胞向Th1分化的能力增强，IFN-α和高水平的IL-6可能在促进B细胞分化成浆细胞，导致自身抗体产生的过程中发挥重要作用。 (2)IL-16作为CD4+T细胞的趋化因子，其编码基因的单核苷酸多态性与GD及其相关眼病发病的易感性相关。
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