摘要
在严重创伤/休克以及临床许多重症都存在血管对血管活性药物治疗的反应减弱甚至不反应的现象(血管低反应性)，这严重影响着这些疾病的救治。精氨酸血管加压素(AVP)是下丘脑合成的九肽神经垂体激素，本室既往研究已证实休克后血管平滑肌细胞存在钙失敏，钙失敏在休克血管低反应性的发生中起重要作用，AVP对休克后血管低反应性和钙失敏有一定的恢复作用，但具体机制尚未完全阐明。本实验室前期研究表明，蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶是重要的调节休克后血管反应性和血管平滑肌细胞钙敏感性的激酶分子；并且Rho激酶参与了AVP的抗休克作用，但是我们发现用Rho激酶的抑制剂Fasudil和Y-27632预处理仅部分拮抗了AVP调节休克后血管反应性和钙敏感性的作用，提示可能有其它机制参与AVP的作用。PKC是一类由多种同工酶组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，存在多种组织分布和功能不同的亚型。而AVP是否通过一种或几种PKC亚型来发挥恢复血管平滑肌细胞钙敏感性和血管反应性的作用，具体调节机制如何，尚不清楚。据此，我们利用大鼠失血性休克模型和缺氧损伤体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)模型，研究AVP对休克血管反应性和血管平滑肌细胞钙敏感性的调节作用，并从钙敏感性调节分子PKC途径入手研究其机制。主要内容包括三部分：①进一步明确AVP恢复失血性休克血管低反应性的作用；②AVP调节休克血管反应性和钙敏感性的作用与PKCα、δ、ε亚型的关系；③AVP激活PKC的机制，包括AVP激活PKC亚型与V1a、V2受体的关系，以及PLC、PLD和PLA2在AVP这一信号传导途径中的作用。 主要实验方法： 第一部分，进一步明确AVP对失血性休克血管反应性的恢复作用 1.整体实验，采用失血性休克大鼠模型(30mmHg，2h，下同)，观察大鼠失血性休克后AVP(0.04、0.1、0.4U/kg)对去甲肾上腺素(NE)诱导肠系膜上动脉(SMA)血管收缩反应和升压效应的影响。 2.离体血管环实验，取失血性休克大鼠肠系膜上动脉，利用离体血管环张力测定技术，观察AVP(5×10-11、5×10-10、5×10-9mol/L)对休克大鼠SMA血管反应性的影响(用血管环对梯度浓度NE的收缩反应反映血管反应性)。 3.VSMC实验，贴块法取大鼠SMA血管平滑肌细胞原代培养，传代至第3-5代接种于Transwell小室建立VSMC双室培养模型，观察缺氧1.5h后VSMC对NE的收缩反应变化以及AVP对缺氧VSMC收缩反应性的影响(通过观察荧光素标记的牛血清白蛋白在Transwell小室中的渗透率变化反映VSMC的收缩反应性)。 第二部分，AVP改善失血性休克血管反应性和血管平滑肌细胞钙敏感性的作用与PKCα、δ和ε亚型的关系 1.血管环实验，取失血性休克大鼠SMA，观察AVP处理后，休克血管环反应性和钙敏感性的变化，以及特异性的PKCα、δ、ε亚型抑制剂预处理对AVP这一作用的影响(以去极化状态下[120mmol/LK+]血管环对梯度浓度Ca2+的收缩反应来反映钙敏感性)。同时取肠系膜动脉检测血管平滑肌肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化的变化，分析PKCα、δ和ε亚型在AVP调节失血性休克血管反应性和钙敏感性中的作用及其与MLC20之间的关系。 2.VSMC实验，采用培养的大鼠肠系膜动脉VSMC，观察在各PKC亚型(α、δ、ε)抑制剂预处理缺氧培养的VSMC下，AVP对VSMC收缩反应性的影响；同时观察AVP对缺氧VSMC胞浆和胞膜成分中PKCα、δ、ε亚型蛋白表达的影响，研究AVP是通过哪一种或几种PKC亚型来调节休克血管反应性。观察AVP和PKC亚型抑制剂对缺氧VSMC肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)活性的影响，探讨AVP恢复血管反应性和血管平滑肌细胞钙敏感性与MLCK/MLCP的关系以及PKC亚型在其中的作用。 第三部分，研究AVP激活PKC的机制 1.血管环实验，取失血性休克大鼠SMA，观察V1a、V2受体拮抗剂预处理对AVP改善休克血管反应性和钙敏感性的影响，同时检测肠系膜动脉平滑肌MLC20磷酸化的变化，研究AVP诱导PKC激活与V1a和V2受体的关系及其机制。 2.VSMC实验，包括：①采用培养的大鼠肠系膜动脉VSMC，观察V1a、V2受体拮抗剂对AVP调节PKCα、δ、ε亚型表达的影响，同时观察VSMC收缩反应性以及MLCK/MLCP活性的变化，分析AVP诱导PKC激活与V1a和V2受体的关系及其机制；②观察缺氧后血管平滑肌细胞三种磷脂酶(PLC、PLD、PLA2)的活性变化以及AVP对其的作用，并进一步观察V1a、V2受体拮抗剂预处理对AVP调节PLC、PLD、PLA2活性的影响，探讨PLC、PLD、PLA2是否参与了休克后AVP诱导PKC激活调节钙敏感性的信号传导过程。 结论： 1.失血性休克后血管反应性显著降低，AVP对休克后全身和局部的血管反应性以及缺氧血管平滑肌细胞的收缩反应性都有较好的恢复作用。 2.AVP可通过激活PKCα和ε亚型，来调节失血性休克大鼠血管平滑肌细胞的钙敏感性和血管反应性，其机制是AVP首先促进血管平滑肌细胞胞浆中无活性的PKC向胞膜转位、并激活，进而抑制MLCP活性，使MLC20磷酸化水平升高，最后增加血管平滑肌细胞的钙敏感性，升高血管反应性。 3.V1a受体拮抗剂预处理可抑制AVP诱导的胞膜PKCα和ε的蛋白表达升高、MCLP活性降低、MLC20磷酸化水平升高和血管反应性升高，同时也可抑制AVP诱导的PLC和PLD活性升高。提示AVP诱导PKC激活的机制可能与V1a受体-PLC/PLD途径有关。
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