摘要
从四川省爆发猪传染性胸膜肺炎的某猪场病猪中，分离到了一株细菌。通过形态学，血清学，分子生物学试验，鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌1型，命名为APP-CYY。药敏试验结果：对四环素、头孢三嗪、氟哌酸、复方新诺明、丙氟哌酸敏感；对卡那霉素、丁氨卡那、先锋霉素Ⅳ、万古霉素、氨苄青霉素、庆大霉素耐药。PCR鉴定根据国外报道，猪胸膜肺炎放线杆菌高度保守的弱溶血毒素APXIVA基因序列，设计的引物，扩增到了预期大小442bp的核苷酸片段。 根据已发表的猪传染性胸膜肺炎血清1型ApxIA(NCBI登陆号：X68595)和TbpB(NCBI登陆号：U16019)基因序列设计合成特异性引物，以分离APP-CYY菌株基因组DNA为模板，分别扩增出了预期约3089bp和736bp的目的片段，然后分别连接到pMD18-T载体中，构建了重组质粒pMD18-T-ApxIA和pMD18-T-TbpB，重组质粒经酶切鉴定和序列分析表明为ApxIA和TbpB基因。该基因包括猪ApxIA和TbpB基因全部开放阅读框，将所获得的猪传染性胸膜肺炎血清1型ApxIA基因序列，同Genbank上有报道性胸膜肺炎放线杆菌血清1、5、9、10型ApxIA基因之间进行同源性比较，同源性在96.8-98.8％之间。测定的TbpB基因序列，仅与GenBank数据库中的两条猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型TbpB基因序列具有较高的同源性，分别为99.7％和99.6％。 运用鉴定正确的重组质粒pMD18-T-ApxIA和pMD18-T-TbpB，酶切回收了ApxIA和TbpB基因片段，并分别插入原核表达载体pET32a(+)，构建原核表达质粒pET32a(+)-ApxIA和pET32al(+)-TbpB。在大肠杆菌BL21中进行诱导，分别表达了ApxIA(125Kd)和TbpB(44Kd)的蛋白，经鉴定此蛋白与预期的胸膜肺炎放线杆菌的ApxIA和TbpB大小相同。Westernblotting分析显示均可与胸膜肺炎放线杆菌阳性血清1型发生反应。
NETL