摘要
目的： 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以β—淀粉样肽(β—Amyloid，Aβ)为核心的老年斑(senile plaques，SP)、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)等。AD的发病机制目前尚未完全阐明，但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强，进一步引起神经细胞凋亡，是导致AD的功能退化和神经变性的基础。p75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor，P75NTR)是神经营养素的低亲和力受体，与AD神经元细胞凋亡有关。p75NTR诱导凋亡的信号通路目前仍不十分清楚，但已广泛公认的是其对c—jun氨基末端激酶(c—jun N-Terminal kinase，JNK)的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤，并进一步通过激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表达，促进或引起细胞凋亡。此外，JNK还能通过诱导细胞色素C的释放进一步活化Caspase—3而导致细胞凋亡。 研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。到目前为止用于AD研究的动物模型很多，其中给小鼠慢性注射D—半乳糖(D—galactose，D—gal)已成为一种常见的制备方法，广泛用于AD等神经退行性疾病的药理学研究。此外，转基因模型是一种病因模型，过量表达人源性突变AD相关基因的转基因鼠，因其具有明确的病因，并能反映AD的部分病理与功能变化，有助于我们了解AD的发病机制，也逐渐成为研究AD的整体模型。 防治AD的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今药理学研究领域的重要课题之一。(一)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin—3—gallate，EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分，研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。Levites等通过研究人类成神经细胞瘤SHSY5Y细胞和大鼠成纤维细胞瘤PC12细胞，发现EGCG能够减少具有神经毒性作用的Ap的产生。因此，本研究拟通过D—半乳糖皮下注射建立的AD小鼠模型及遗传性的APP/PS1转基因小鼠，采用Nissl、TUNEL染色、免疫组化、Western blot等方法研究D—半乳糖对小鼠认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、Aβ(1—40)、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor Protein，APP)、促凋亡蛋白caspase—3及P75—JNK-P53凋亡相关通路的影响，以及9月龄的APP/PS1转基因小鼠上述指标的改变，同时进一步探讨EGCG对两种AD小鼠模型的神经保护作用及其作用机制。 材料与方法： D—半乳糖诱导的AD模型鼠实验：取昆明系小鼠96只，随机分成6组，每组16只，即空白对照组(Control)、模型组1(D—gal+ddH2O)、模型组2(D—gal+oil)、VE阳性对照组(D—gal+280IU/kg VE)、EGCG低剂量处理组(D—gal+2 mg/kg EGCG)、EGCG高剂量处理组(D—gal+6 mg/kg EGCG)。每日给两模型组及VE阳性对照组、EGCG低剂量及高剂量处理组小鼠按150 mg/kg皮下注射3%的D—半乳糖一次，空白对照组小鼠每天皮下注射等体积的生理盐水一次，连续注射6周。第三周开始给VE阳性对照组、EGCG低剂量及高剂量处理组小鼠每日分别按280IU/kg灌胃5.6%VE、按2 mg/kg灌胃0.04%的EGCG、按6 mg/kg灌胃0.12%的EGCG一次，空白对照组及模型组1小鼠灌胃等量的双蒸水一次，模型组2灌胃等量的大豆油一次，连续给药4周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等行为学检测，其间继续给药。行为学结束后，快速取一部分小鼠海马入—80℃中冻存，分别进行SOD、GSH-Px酶活性、MDA含量的测定及Western blot印迹分析APP、caspase—3、P75、JNK2及P53等蛋白表达水平。另一部分小鼠进行脑灌流固定，分别进行HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及Aβ(1—40)、caspase—3、APP等免疫组化的检测。 APP/PS1转基因小鼠实验取C57小鼠10只及APP/PS1小鼠20只，随机分成3组：C57对照组(Control)、模型组(APP/PS1)、实验组(APP/PS1+2 mg/kg EGCG)。每日给实验组APP/PS1转基因小鼠按2 mg/kg灌胃0.04%的EGCG一次，给对照组及模型组小鼠灌胃等量的双蒸水一次，连续灌胃4周。最后两日对小鼠进行避暗实验的行为学检测，其间继续给药。行为学结束后，快速取一部分鼠海马入—80℃中冻存，进行Western blot印迹分析P75、JNK2及P53等蛋白表达水平。另一部分小鼠进行脑灌流固定，进行HE染色及Aβ(1—40)免疫组化的检测。 结论： 1、EGCG能够改善D—半乳糖诱导的AD模型小鼠及APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。 2、EGCG能够提高D—半乳糖诱导的AD模型小鼠海马内的抗氧化酶活性，发挥有效的抗氧化作用。 3、EGCG通过抑制D—半乳糖诱导的AD模型小鼠大脑皮层及海马内的APP及Aβ(1—40)蛋白水平，对神经细胞发挥一定的保护作用。 4、EGCG通过抑制D—半乳糖诱导的AD模型小鼠及APP/PS1转基因小鼠海马内p751CD、JNK2及P53凋亡通路相关蛋白表达水平，进一步抑制caspase—3蛋白活性，对神经细胞发挥有效的抗凋亡作用。
NETL