摘要
目的： 乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是转铁蛋白家族中的一种分子量约80，000的糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的各种体液中，如乳汁、血液、唾液、泪液，胆汁、精液及胰液等。既往研究表明，乳铁蛋白除了抗炎、抗感染、抗肿瘤及免疫调节等多种作用外，还在炎性痛过程中产生镇痛作用。但乳铁蛋白是否在神经病理性痛发挥镇痛作用，如果有镇痛作用，其镇痛作用的分子机制如何，尚需进一步探讨。本研究采用坐骨神经慢性束缚损伤模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI)，从行为学、细胞化学和分子生物学等多层面探讨：(1)乳铁蛋白在神经病理性痛是否能产生镇痛作用；(2)乳铁蛋白在神经病理性痛的镇痛作用是否与NO—cGMP-PKG信号通路的激活有关；(3)乳铁蛋白在神经病理性痛的镇痛作用是否与阿片受体的激活有关；(4)乳铁蛋白产生镇痛作用的不同阶段信号分子蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)的表达的变化。目的在于证实乳铁蛋白在神经病理性痛过程中的镇痛作用，阐明其发挥镇痛作用的分子机制，为临床治疗神经病理性痛提供理论参考和实践指导的依据。 材料与方法： 1.大鼠坐骨神经慢性束缚损伤神经病理性痛模型(CCI)的制作 雄性Sprague—Dawley(SD)大鼠腹腔内注射苯巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉，消毒后，沿大鼠右侧后肢大腿外侧切皮，暴露坐骨神经干，用4号铬制羊肠线环绕神经干分别作4个轻度结扎，结扎间距为1.0-1.5mm，结扎强度以引起同侧小腿肌肉轻度颤动为宜。最后缝合伤口。 2.乳铁蛋白对神经病理性痛的镇痛作用 将CCI大鼠分为乳铁蛋白腹腔内注射组和鞘内注射组两个大组，腹腔内注射组进一步分为30mg/kg(IP30组)、100mg/kg(IP100组)、300mg/kg(IP300组)3个剂量组；鞘内注射组进一步分为1μg(IT1组)、10pg(IT10组)、100μg(IT100组)3个剂量组，对照组注射等容积生理盐水，每组动物为8只，用热刺激仪，观测大鼠后爪回缩潜伏期(paw withdrawal latency，PWL)，每30min一次，直至180min。腹腔内注射组，将PWL换算为最大可能效应百分数(maximum possible effect，MPE%)来评价乳铁蛋白的镇痛效应。MPE%=(给药后PWL—给药前PWL)×100/(20-给药前PWL)。鞘内注射组，采用曲线下面积法来评价乳铁蛋白的镇痛效应。 3.乳铁蛋白的镇痛效应与NO—cGMP-PKG信号通路的激活 将CCI大鼠分为5大组，鞘内给予100μg乳铁蛋白10min后，各组分别鞘内注射不同剂量的工具药及其等容积溶媒：L—NAME(非特异性一氧化氮合酶抑制剂)、7—NI(神经性一氧化氮合酶抑制剂)、ODQ(鸟苷环化酶抑制剂)、KT—5823(特异性PKG抑制剂)、格列本脲(ATP敏感K+通道阻断剂)。每个剂量组8只大鼠，通过热刺激仪记录大鼠PWL，采用曲线下面积法，分析各工具药对鞘内注射乳铁蛋白对神经病理性痛大鼠的镇痛作用的影响。 4.乳铁蛋白的镇痛作用与阿片受体的关系 将CCI大鼠随机分为4组，每组8只，鞘内给予100μg乳铁蛋白10min后，各组分别鞘内注射纳洛酮(非选择性阿片受体拮抗剂)10μg，CTOP(选择性μ阿片受体拮抗剂)0.1μg、1.0μg及等容积生理盐水对照，通过热刺激仪记录大鼠PWL，采用曲线下面积法，分析纳洛酮和CTOP对鞘内注射乳铁蛋白在神经病理性痛大鼠的镇痛作用的影响。 5.鞘内乳铁蛋白镇痛过程中PKG的表达 将CCI大鼠分为6组，每组24只，分别为空白对照组(不给药)、生理盐水对照组(等容积生理盐水)、乳铁蛋白组(乳铁蛋白100μg)、DMSO组(乳铁蛋白100μg+DMSO10μl)、ODQ组(乳铁蛋白100μg+ODQ10μg)及KT—5823组(乳铁蛋白100μg+KT582310μg)，给药后30min、60min、90min等时间点各取4只大鼠脊髓标本，免疫组化和western blot检测PKG的表达的改变。 6.统计学分析 所有计量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示，SPSS13.0统计学软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，Tukey's检验。P<0.05认为有统计学意义。 实验结果： 1.乳铁蛋白在神经病理性痛的镇痛作用 CCI大鼠腹腔内注射乳铁蛋白后30min，即产生镇痛效应，最大效应发生在注射乳铁蛋白后60min，各剂量组MPE分别为6.98±2.07(IP10)、14.76±2.44(IP100)、42.57±5.48(IP300)，显著高于对照组MPE值3.14±1.82(P<0.05)。给药后180min，镇痛效应消失。 CCI大鼠鞘内注射乳铁蛋白后30min，即开始产生镇痛效应，持续约180min，最大效应产生于注射乳铁蛋白后60min，各剂量组曲线下面积(AUC)分别为1103.41±104.82(IT1)、1347.98±111.94(IT10)、1426.85±70.46(IT100)，显著高于对照组AUC值904.83±50.17(P<0.05)。 2.乳铁蛋白镇痛的镇痛效应与NO—cGMP-PKG信号通路的激活 各工具药组的曲线下面积分别为：L—NAME(1374.52±77.61，1287.96±50.74，950.99±68.73)，7—NI(1325.74±70.81，1173.75±67.49，976.58±50.89)，ODQ(1394.68±99.43，1254.54±65.17，964.52±100.24)，KT—5823(1274.25±103.21，971.87±87.63，940.65±64.28)，格列本脲(1375.95±95.83，1065.62±58.39，987.91±60.85)，其中部分中小剂量组和所有大剂量组的AUC显著低于各自的对照组(P<0.05)。单独应用各工具药最大剂量本身不产生镇痛效应，其AUC与对照组的差异无显著性。 3.乳铁蛋白的镇痛效应与阿片受体的关系 各工具药组曲线下面积分别为：纳洛酮(1298.47±89.42)，CTOP0.1(1347.98±97.55)，CTOP1.0(1287.45±68.41)，与对照组(1421.85±70.56)相比，差异无显著性(P>0.05)。 4.鞘内乳铁蛋白镇痛过程中PKG表达 免疫荧光结果显示，大鼠脊髓PKG阳性反应为绿色荧光，弥漫性分布，与空白对照组相比，生理盐水组的荧光强度无明显改变，而乳铁蛋白组的荧光强度则明显增强(P<0.05)；与乳铁蛋白组相比，DMSO组荧光强度无明显改变，而ODQ组及KT—5823组的荧光强度明显降低(P<0.05)。与生理盐水组相比，大鼠鞘内注射乳铁蛋白后30min、60min及90min，荧光强度增强(P<0.05)，在60min时荧光强度最大(P<0.05)；免疫印迹结果显示，与空白对照组相比，生理盐水组PKG表达无明显改变，而乳铁蛋白组PKG表达则明显增多(P<0.05)；与乳铁蛋白组相比，DMSO组PKG表达无明显改变，而ODQ组及KT—5823组PKG表达显著减少(P<0.05)。与生理盐水组相比，大鼠鞘内注射乳铁蛋白后30min、60min及90min，脊髓PKG表达均增多(P<0.05)，在60min时PKG表达最多(P<0.05)。而乳铁蛋白产生的镇痛作用的最大效应发生于注射乳铁蛋白后60min，这也正是脊髓PKG表达量增加最显著的时间。免疫荧光与免疫印迹结果均提示，鞘内注射乳铁蛋白引起脊髓PKG表达增加，鞘内注射鸟苷环化酶(guanylyl—cyclase，GC)和PKG抑制剂则明显抑制了脊髓PKG的表达，乳铁蛋白在CCI大鼠产生的镇痛作用与脊髓PKG表达增多有关。 结论： 1.腹腔内及鞘内注射乳铁蛋白均在神经病理性痛产生镇痛效应，其镇痛效应呈剂量依赖性，最大镇痛效应产生于注射乳铁蛋白后60min； 2.鞘内注射乳铁蛋白在神经病理性痛产生镇痛效应与NO—cGMP-PKG信号通路的激活有关； 3.鞘内注射乳铁蛋白对CCI大鼠的镇痛作用在脊髓水平与阿片受体的激活无关； 4.鞘内注射乳铁蛋白诱导脊髓PKG表达增加，PKG在脊髓的表达随着鞘内注射乳铁蛋白产生的镇痛作用的增强而增加。
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