摘要
目的：①探讨单个氨基酸对白念珠菌菌丝形成的影响。②探讨不同pH值和氧气对白念珠菌菌丝形成的影响。③探讨电子传递链对白念珠菌菌丝形成的影响。④探讨温度和二氧化碳对白念珠菌形态转换的影响及其致病性差异。⑤分离纯化白念珠菌菌丝相和酵母相细胞壁甘露聚糖并进行物化性质及结构分析。⑥分离纯化白念珠菌菌丝相和酵母相细胞壁不溶性葡聚糖并进行结构分析。⑦探讨真菌胞壁多糖诱导单核巨噬细胞THP—1免疫应答机制。 方法：⑴用0.67%的酵母氮源基础培养基和2%葡萄糖配制成SD合成培养基，37℃恒温摇床培养，研究单个天然氨基酸对白念珠菌形态学的影响，并分别通过不添加碳源和厌氧条件下培养观察对精氨酸诱导的菌丝形成的影响。⑵通过调节Muller—Hinton液体培养基的pH值和去除培养基中的氧气来观察白念珠菌的生长曲线，倍增时间和菌丝形成率的变化。⑶用含10%小牛血清的RPMI1640在5%CO237℃培养条件下诱导白念珠菌菌丝形成，通过加用电子传递链的抑制剂和激动剂，观察白念珠菌菌丝形成的影响、生长曲线和菌丝形成率。MTT法检测对白念珠菌的抑制率。⑷通过调整温度和二氧化碳的浓度观察白念珠菌在含荧光桃红B的改良Lee培养基上WO形态之间的相互转换，并通过与单核巨噬细胞THP—1共培养，观察单核巨噬细胞THP—1胞内和胞外杀伤白念珠菌WO两种形态的差异。⑸通过37℃恒温RPMI1640培养体外获得白念珠菌菌丝相，通过37℃恒温SDB培养体外获得白念珠菌酵母相。稀碱法提取粗多糖，透析和过阴离子交换柱层析纯化，改良苯酚硫酸法收集洗脱液，合并主糖峰管。高效凝胶过滤色谱、糖组成分析、甲基化分析和核磁共振进行物化性质和结构分析。⑹通过37℃恒温RPMI1640培养体外获得白念珠菌菌丝相，通过37℃恒温SDB培养体外获得白念珠菌酵母相。采用氢氧化钠、盐酸和乙醇提取白念珠菌的细胞壁不溶性葡聚糖，硫酸化后变成可溶性葡聚糖，同时进行单糖组成分析、甲基化分析以及核磁共振进行结构分析。⑺通过RT-PCR检测Dectin—1和TNF-α mRNA的表达，ELISA和流式细胞仪检测细胞分泌TNF-α和细胞膜Dectin—1蛋白的表达。 结果：①在含10mmol/L的L—精氨酸的SD液体培养基中，可见大量的菌丝。在含10mmol/L的L—半胱氨酸、L—苏氨酸、L—缬氨酸和L—色氨酸的SD液体培养基中，可见典型的酵母细胞，未见菌丝。②在无氧气的液体培养基中，白念珠菌生长缓慢，不能产生菌丝，只有酵母细胞形成。生长曲线的延缓期内各组没有明显差异，而在生长的对数期pH3和pH4的条件下念珠菌生长速度明显慢于pH5、pH6、pH7、pH8和pH9。菌丝形成率在pH3、pH4和pH5条件下不到20%，而在pH6、pH7、pH8和pH9条件下可高达70%。③氯仿和二甲基亚砜的溶媒对照与空白对照之间对白念珠菌的生长和菌丝形成的影响无差异。噻吩甲酰三氟丙酮(TTFA)和苯甲羟肟酸作用于白念珠菌24h后细胞形态以酵母为主。④在0.03%CO225℃、0.03%CO237℃和5%CO237℃三种培养条件下，白念珠菌W→O转换的O菌落占总菌落数的比例分别为0.572±0.087、0.920±0.030和0.985±0.026(P<0.05)。在0.03%CO225℃、0.03%CO237℃和5%CO237℃三种培养条件下，白念珠菌O→W转换的O菌落占总菌落数的比例分别为0.60±0.114、0.983±0.003和0.998±0.003(P<0.05)。⑤从菌丝相和酵母相白念珠菌细胞壁各获得一个甘露聚糖纯品，高效凝胶过滤色谱上呈对称性单峰，分子量分别为23KD和30KD。甲基化分析显示这二者均具有位于非还原末端甘露糖和1，2—，1，3—，1，2，6—连接的甘露糖基。核磁共振显示以α—构型为主，存在β—构型的甘露糖基。⑥从菌丝相和酵母相白念珠菌细胞壁各获得一个不溶性葡聚糖纯品。甲基化分析显示仅有1，3—连接的葡聚糖。核磁共振显示为β—构型的葡聚糖。⑦ Zymosan可以诱导单核巨噬细胞THP—1的Dectin—1和TNF-α mRNA的表达，灭活菌丝相、灭活酵母相、Zymosan、菌丝相甘露聚糖、酵母相甘露聚糖和不溶性葡聚糖均能诱导单核巨噬细胞THP—1分泌TNF-α，均呈剂量依赖性和时间依赖性。灭活菌丝相、灭活酵母相、Zymosan和不溶性葡聚糖均能诱导单核巨噬细胞THP—1的Dectin—1蛋白表达，呈时间依赖性，加用Laminarin后Dectin—1蛋白表达减弱。 结论：⑴精氨酸可以诱导白念珠菌菌丝形成，厌氧条件下精氨酸不能诱导白念珠菌菌丝形成。⑵厌氧条件抑制白念珠菌的菌丝形成。白念珠菌在pH3～9的范围内均能生长，偏酸性环境有利于白念珠菌酵母形成，偏碱性的环境有助于菌丝的形成。⑶经典呼吸链和替代途径电子传递链的抑制剂能不同程度抑制白念珠菌的菌丝形成，替代氧化途径是白念珠菌菌丝形成的主要途径，可能与白念珠菌细胞内氧化应激压力有关。⑷白念珠菌W向O转换的过程中，37℃有利于WO转换，而且5%的CO2浓度能更进一步促进白念珠菌的WO转换。白念珠菌O向W转换的过程中，37℃有利于维持白念珠菌的O状态，而且5%的CO2浓度能更进一步维持白念珠菌的O状态。单核巨噬细胞对O相白念珠菌的杀伤效应明显强于W相白念珠菌。⑸菌丝相和酵母相的甘露聚糖结构为以1，6—连接的甘露聚糖为主链，在2—O上有1，2—连接和1，3—连接甘露糖构成的支链，酵母相甘露聚糖1，2—连接的甘露糖支链更长。⑹白念珠菌菌丝相和酵母相的不溶性葡聚糖连接结构均为β，1—3连接的葡聚糖，二者在葡聚糖的组成、连接键方式和构型方面一致。⑺灭活白念珠菌酵母相比灭活白念珠菌菌丝相能更强地诱导THP—1分泌TNF-α。白念珠菌酵母相胞壁甘露聚糖比菌丝相胞壁甘露聚糖能更强地诱导THP—1分泌TNF-α。Zymosan和不溶性葡聚糖通过Dectin—1介导THP—1分泌TNF-α。
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