摘要
花生是世界四大油料作物之一，也是我国单产、总产和出口创汇最高的油料作物。提高花生籽仁含油量是花生育种的重要目标之一。植物转基因技术可根据育种目标有针对性地转移单个或少数几个基因，避免了大量不良基因的干扰，所需的群体小，周期短，比常规育种更有效。生物技术的发展，为利用基因工程提高花生含油量的育种工作奠定了基础。反义RNA技术是利用人工合成的一段DNA(或cDNA)，反向与启动子连接，将其导入受体细胞内转录成反义RNA，反义RNA与受体细胞靶基因转录的RNA分子碱基互补，形成复合体，抑制目标基因的表达。植物油脂、蛋白质合成途径中糖酵解产物-磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)可作为油脂、蛋白质生物合成的共同底物，PEPCase(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)是油脂合成途径中一个潜在关键调控点。利用反义RNA技术，抑制花生籽仁中PEPCase基因表达，降低PEPCase量，减少进入蛋白质合成途径的PEP量，使更多PEP流向脂肪酸的合成途径，为油脂合成提供更多底物，可有效提高花生籽仁含油量。 本研究利用同源克隆技术获得花生PEPCase基因的cDNA片段，将目的片段与花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)反向连接，构建反义表达载体；用含有质粒pGBVE(携带)γ-维生素E甲基转移酶基因(γ，-tmt)和筛选标记基因bar)的根癌农杆菌GV3101侵染预培养4d的花生胚小叶，进行遗传转化，分析17个花生栽培品种(11个大花生品种和6个小花生品种)的植株再生率和基因转化效率，筛选遗传转化率较高的品种。利用PCR技术检测抗PPT转基因植株中目的基因的整合情况。主要研究结果如下： 1.花生PEPCase基因cDNA片段克隆及其反义表达载体构建 根据GenBank上发表的花生PEPCase基因序列(EU391629)设计引花生PEPCase基因反义表达载体构建与遗传转化高效基因型的筛选物，用荔蒲大花生cDNA为模板进行RT-PCR扩增PEPCase基因片段，琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增的目的片段，并与克隆载体pGM-Teasy连接，获得重组质粒pGMPEP，序列分析表明，获得的PEPCase基因序列长886bp，与GenBank发表的PEPCase基因序列的同源性为99.77％，氨基酸序列同源性100％。重组子pGMPEP和质粒pBI121分别用BamHI和SacI双酶切，并回收PEPCase基因片段和切除GUS基因的pBI121载体DNA，反向目的基因片段与回收载体连接，构建成PEPCase基因的反义表达载体pBGPEP。 2.花生遗传转化高效基因型的筛选 不同基因型之间的分化率、再生率和转化率差异显著。农杆菌侵染后分化率较高的品种有：丰花2号、05A110、花选9号、临花5号和莒南2号，分化率分别是28.43％、18.40％、14.48、12.07％和10.52％；再生率较高的品种有：丰花2号、05A110、临花5号、花选9号和莒南2号，再生率分别是67.57％、32.93％、24.77％、21.41％和21.21％。基因转化率较高的品种是：莒南2号、临花5号、HY-1和丰花2号，转化率分别是3.36％、1.99％、1.57％和0.47％；综合外植体的生长情况，确定莒南2号、临花5号、丰花2号和HY-1四种基因型适宜作基因转化。获得了转基因植株，PCR检测证明目的基因已整合到花生基因组中。
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