摘要
目的： 凝血因子Ⅻ（coagulation factorⅫ，FⅫ）也称Hageman因子，在传统的凝血瀑布理论中，它是内源性凝血途径的启动因子，属于凝血接触相蛋白。FⅫ的活化同时启动了内源凝血途径和纤溶途径。遗传和环境因素都可影响FⅫ水平。遗传性FⅫ缺陷症最早由Ratnoff等于1955年报道，其呈常染色体隐性遗传，部分患者可表现为显性遗传，是一种罕见的凝血因子缺陷症，在人群中发病率还不十分清楚。严重遗传性FⅫ缺乏患者临床上无明显的出血表现，检验结果显示部分活化凝血活酶时间（APTT）的延长但没有出血倾向，相反却往往有血栓形成的危险。国外对遗传性FⅫ缺陷症家系进行基因诊断的报道较多，但国内的报道较少。本文亦对一个遗传性凝血因子Ⅻ缺陷症家系的FⅫ进行表型诊断及分子水平的研究，旨在参与其分子发病机制的探讨。 方法： 一、遗传性FⅫ缺陷症家系资料 先证者，男，67岁，因“胆总管结石”就诊，术前常规凝血象检查发现APTT79．1s/35s，PT12．6s/12s，凝血因子检查发现FⅫ：C活性仅为2%（正常参考范围为72%～130）。经查初步诊断为FⅫ缺陷症。先证者肝功能正常，平素无明显出血症状，无长期服用药物史，询问其家系成员均无出血史。先证者父母非近亲结婚。 二、遗传性FⅫ缺陷症家系成员标本的采集、处理 在征得先证者及家系成员知情同意后，采集该家系9名成员静脉血（家系图参见图3），129mmol/L枸橼酸三钠1：9抗凝，4℃4000 r/min离心15 min，取乏血小板血浆，分装，-70℃保存。用树脂型基因组DNA提取试剂盒（上海赛百盛基因技术有限公司）抽提家系所有成员外周血单个核细胞的基因组DNA，-70℃保存待用。 三、遗传性FⅫ缺陷症家系凝血象检测 APTT、PT、FⅧ：C、FⅨ：C、FⅪ：C、FⅫ：C检测试剂采用法国STAGO公司试剂盒，仪器为STA-R（Automated Coagulation Laboratory）血凝仪，因子活性检测采用一期凝固法。FⅫ：Ag检测采用ELISA法（Cedarlane Laboratories Limited公司试剂）。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。 四、遗传性FⅫ缺陷症家系基因分析 根据FXⅫ基因序列（GenBank AF538691），应用primer5软件共设计7对引物以覆盖FⅫ基因的所有外显子区域及其侧翼序列（见表2）。PCR反应在PCR扩增仪（ABI Therml cycler2720，USA）上进行，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，根据引物不同分别在相应退火温度（60℃～64℃）退火30 s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物5μl在L2％琼脂糖凝胶上电泳，用Goldview标记PCR产物大小。PCR产物进行胶回收纯化（上海桑尼生物科技有限公司胶纯化回收试剂盒），以制备测序模板，采用Sanger双脱氧链终止法在ABI3730XL测序仪上进行测序，用Chromas软件和DNAMAN软件将测序结果与美国NCBI基因库所公布的FⅫ基因序列（GenBank AF538691）进行比对（Blaster），寻找基因突变，如有发现突变则反向测序予以证实。 结果： 一、遗传性FⅫ缺陷症家系凝血象检测结果 先证者及其胞弟APTT明显延长，分别为APTT79．1s/35s、APTT84．6s/35s，先证者大儿子APTT稍高，为42．1s/35s。家系其他成员APTT正常范围。先证者及其胞弟FⅫ活性严重减低，分别低至2％、3％，其FⅫ：Ag水平都<1％；先证者胞兄及大儿子、小儿子FⅫ活性分别为39％、29%、34％，接近正常活性的一半。FⅫ：Ag水平分别为32％、30%、37％；小孙女FⅫ活性为71％，稍低于正常水平，FⅫ：Ag活性为705。该家系中FⅫ：C缺陷患者同时伴随FⅫ：Ag相应下降，表现为交叉反应物质阴性。 二、遗传性FⅫ缺陷症家系基因分析 对该遗传性FⅫ缺陷症家系成员所有14个外显子及侧翼序列进行PCR扩增，纯化扩增产物后，进行测序，结果发现，先证者、其胞兄、胞弟、大儿子、小儿子、小孙女启动子区46位多态性都为46T/T型，侄女、大孙女、二孙女的启动子区46位多态性为46C/T型。另外先证者、其胞弟、大儿子、小儿子10号外显子7142位插入一个核苷酸C（7142insertC），且均为7142insertC杂合，使得346位赖氨酸变成谷氨酸，即Lys（K）→Gln（Q）（K346Q），该位点已于2005年国内首报；另外，考虑到先证者、胞弟的极低FⅫ水平，而普通测序对其外显子5+6的测序结果不理想，我们针对外显子5+6进行克隆测序。结果显示：先证者、胞弟5号外显子5741-5742位分别缺失碱基C和碱基A，在正常对照组未发现此突变，排除基因多态性。5741delC，5742delA为国际首报，推测其与7142insertC复合杂合，共同导致先证者、胞弟FⅫ水平的降低，但具体的作用机制尚待进一步研究。 结论： FⅫ基因启动子区第46位核苷酸存在一个常见的多态性C→T，与血浆FⅫ的活性和抗原水平有关，携带T/T基因型者FⅫ血浆水平明显减低；FⅫ基因10号外显子7142位插入一个核苷酸C（7142insertC），使得346位氨基酸Lys（K）变成Gln（Q）（K346Q），读码框架移位，导致终止密码子提前出现，所产生的蛋白为414个氨基酸为截短蛋白（正常为596个氨基酸）；5号外显子5741delC，5742delA，推测其与7142insertC复合杂合，共同导致FⅫ水平的降低，但具体的作用机制尚待进一步研究。
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