摘要
猪细小病毒（PPV）与伪狂犬病毒（PRV）是引起猪繁殖障碍的两个主要病原。PPV和PRV引起的疾病在我国有很高的感染率和发病率，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。传统的常规疫苗对防制PPV和PRV的感染有一定的效果，但是存在不可避免的缺陷，为了更好的控制PPV和PRV感染，研制更加安全有效的PPV-PRV二价基因工程疫苗是解决这一问题的最好途径。 伪狂犬病病毒基因组为一双链、线状DNA，在长约150kb的基因组上存在许多与病毒复制无关的非必需基因，这些基因可供外源基因的插入，而使之能成为活载体疫苗。根据AnaⅠ.Ranz等报道的PPVNADL-2株病毒基因组序列设计了一对包含其结构蛋白VP2基因的PCR引物，分别在引物的上、下游5’端引入了BamHⅠ酶切位点，以含PPVNADL-2株全部序列的GH质粒为模板，扩增了完整的PPVVP2基因和部分VP1基因，将扩增的目的基因VP2克隆入PMD18-T载体内，构建了重组质粒。经PCR鉴定证明插入片段是VP2基因，并将重组质粒命名为PT-GFP。用BamHⅠ酶切扩增的VP2基因和载体PG质粒并回收，将载体PG质粒去磷酸化后与目的片段VP2基因连接，构建了重组质粒PG-VP2。通过PCR扩增、酶切、序列测定证明，该转移载体构建成功。经酶切鉴定证明插入片断是VP2基因片断，并证明插入方向正确。 利用脂质体介导的方法，将转移载体质粒PG-VP2与PRV基因组DNA共转染PK-15细胞。于荧光显微镜下48小时便能观察到绿色荧光，用吸管将有荧光的病变细胞吸出，经过三次连续传代得到了纯化的重组病毒。并经过PCR和酶切鉴定重组病毒构建成功。为进一步制备抗猪细小病毒的重组伪狂犬病毒活载体疫苗奠定了基础。
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