摘要
论文对本实验室鉴定的鸭瘟病毒（DPV）UL27基因（GenBank登录号EF608147）开展了以下系列研究：DPV UL27基因生物信息学分析及多肽抗原表位预测，主要抗原域的克隆、原核表达和抗体制备纯化及以此为基础的亚细胞定位，运用免疫印迹和荧光定量方法分析表达实相和转录实相。应用表达蛋白制备亚单位疫苗进行攻毒保护试验，结果如下： 1．采用软件DNAStar Protean程序，综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数，对DPV CHv毒株UL27基因（GenBank登录号EF608147）的氨基酸序列进行B细胞表位预测，分析结果显示在位于UL27蛋白羧基端第aa151-550区域内含有主要抗原决定簇。 2．以DPV CHv毒株基因组为模板，用primer5．0软件设计一对引物，整体扩增涵盖具有优势表位的基因片段（451-1650bp），进行原核表达。用原核表达产物作为免疫原制备兔抗DPV多克隆血清，以此抗血清进行Western blotting检测显示抗血清可与该融合蛋白发生结合反应。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析两种方法对其进行纯化，获得较高纯度的重组蛋白（UL27M）。过柱纯化蛋白分别对家兔进行免疫，制备兔高免血清，ELISA效价为1：819200，具有中和活性。 3．通过免疫荧光对病毒感染DEF的亚细胞定位发现特异性荧光可最早在感染后8h的核膜上检测到，12h核膜周围荧光数量增多，24h荧光数量达到一个相对高的水平并向胞浆转移，36h荧光基本分布胞膜边缘，48h荧光分布于细胞各个区域。 4．鸭瘟强毒体外感染鸭的宿主细胞UL27基因转录及表达时相分析。荧光定量PCR分析结果显示DPV UL27基因转录产物最早出现于感染后6h，于感染后14h达到高峰，之后一直维持到60h。这种转录谱具有疱疹病毒晚期基因的典型特征。以制备的兔抗UL27M蛋白IgG为一抗，对感染鸭瘟强毒的DEF进行Western blot分析结果显示在感染60～72h之间的细胞蛋白提取物中可观察到与DPV UL27蛋白预测大小约110kD相一致的条带，在感染后60h达到最大值，一直持续到感染后72h。基因转录及表达时相分析推测DPV UL27基因可能是晚期基因。
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