摘要
P11蛋白（calpact，inⅠ，light chain）属于S100家族的一员，又称为S100A10，是一个包含97个氨基酸残基的多肽（11Kda）。P11通常作为膜联蛋白（annexinⅡ）异四聚体复合物（AⅡt）的亚基调节血液纤溶系统，可以单独的或者与annexinⅡ以复合物的形式刺激组织型纤溶酶原活性因子（t-PA）调节纤溶酶原活性。在体内P11通常以它的C-端赖氨酸残基（K-95和K-96）结合在纤溶酶原上，与纤溶酶原的kringle结构相结合。P11的C末端赖氨酸构成t-PA、纤溶酶原结合位点，在溶栓系统中P11刺激t-PA-催化的纤溶酶原激活作用增强46倍。P11与纤溶酶在特异的位点结合，形成P11-纤溶酶复合物，刺激纤溶酶自水解，从而在某些细胞表面产生局部的瞬间纤溶酶高活性。天然葡激酶（staphylokinase，Sak）是溶原型金黄色葡萄球菌合成的一种单链蛋白含有136个氨基酸，作为溶栓药物目前已上市。它可与血栓表面的纤溶酶原1：1结合形成复合物，并进一步激活纤溶系统，具有较强的溶栓活性。水蛭素是由65个氨基酸残基组成的单链多肽，能特异、高亲和性地抑制凝血酶的活性，水蛭素C-端12肽是一个具有抗凝功能的结构片段。为此我们构建了编码水蛭素C端12肽与P11融合蛋白的基因，对比研究在P11蛋白N-端和C-端融合后生物活性的变化，获得具有溶栓抗凝作用的双功能蛋白；实现融合基因在大肠杆菌中的高效分泌表达，建立简便、快捷的分离纯化方法，为探讨其药用的可能性奠定了基础。 本论文对P11的及其融合蛋白的功能进行了以下两方面的研究： 1.相关研究指出P11具有一定的溶栓活性，能激活血纤溶系统，为此我们制备了P11蛋白。在研究中通过对P11和SAK混合物、P11、SAK的溶栓活性进行检测，研究发现P11与SAK以1/1摩尔比混合溶栓效果显著增强。因此，以P11作为溶栓药物的增效剂来增强溶栓活性将具有重要的临床应用价值。 2.合成水蛭素12肽基因的编码序列，通过DNA重组技术与P11核苷酸序列连接构建了融合基因，并对比分析了N端和C端融合策略对其生物活性的影响。实现了融合基因在大肠杆菌中获得高效表达，经离子交换层析法进行纯化，体外测活实验结果表明，表达的融合蛋白具有预期的纤溶活性和抗凝活性。
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