摘要
鳜鱼是中国广为养殖的重要经济鱼类，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病毒性疾病，成为鳜鱼养殖发展的瓶颈之一。为了认识病原的本质，有针对性地进行疾病防治，在本实验室从患病鳜鱼组织中观察到鳜鱼球形病毒(Sinipercachuatsi spherical virus，SCSV)、弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV)和杆状病毒(Siniperca chuatsi baculovirus，SCBV)，并证实球形和弹状两种鳜鱼病毒共感染引起宿主细胞超微变化的基础上，利用电镜技术，辅助进行病毒挑斑分离，围绕鳜鱼弹状病毒的鉴定、全基因组测序及功能基因表达、分析等开展研究。主要研究方法和结果如下： 1、借助电镜技术辅助挑取病毒斑，分离SCRV。取患典型病毒感染出血症的鳜鱼组织，制备组织悬液，从10-1到10-4作10倍系列稀释后，分别接种到草鱼鳍条细胞(grass carp fins，GCF)中培养，在感染后12、18、24、30和36 h等时间段收集细胞，制备超薄切片后进行电镜观察。结果显示：SCRV与球形病毒(SCSV)共感染同一个细胞，但共感染的两种病毒增殖时段是不同步的，弹状病毒继球形病毒大量增殖之后才开始出现，而且不同病毒感染细胞产生的空斑大小也有所不同。利用这些特点，经7轮挑斑，从共感染的两种病毒中，分离出一端为圆锥体、另一端为平底的典型子弹状形态，大小约为76-118 nm X29-52 nm的SCRV。 2、SCRV的敏感细胞及理化性质。利用不同的鱼类细胞，如草鱼鳍条细胞，鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)、肥头鲤细胞(Fathead minnow, FHM)、鲑鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo，CHSE-214)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad，RTG-2)等，接种SCRV后，持续观察和记录细胞病变的情况，结果显示，除GCF外，SCRV还可引起FHM和EPC细胞产生病变。理化性质测定表明，SCRV对氯仿、温度和pH敏感，在46℃水浴1小时后病毒完全灭活；当在pH低于3或高于10的环境中，SCRV也彻底灭活。 3、SCRV的分子生物学特征。经差速和蔗糖密度梯度离心，提纯SCRV，并经12％SDS-PAGE电泳，显示SCRV有血条主要蛋白带，从大到小分子量分别约200 kDa以上、65 kDa、47 kDa、35 kDa和28 kDa。参照已知资料分析，推测它们依次是RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNA polymerase protein，L)、糖蛋白(Glycoprotein，G)、核蛋白(nucleoprotein，N)、磷酸化蛋白(Phosphoprotein，P)和基质蛋白(Matrix protein，M)蛋白。进一步制备SCRV RNA，经0.7％琼脂糖凝胶电泳，显示SCRV的基因组是唯一、分子量约为11kb的RNA。 4、SCRV基因的克隆、测序及分子进化分析。参照已知弹状病毒N基因保守区序列，先设计一对简并引物，通过RT-PCR的方法成功克隆到了SCRV N基因部分片段并测序。再根据所测片段序列设计反向引物，通过3'RACE的方法获得了基因组3’端完整的序列。然后，通过基因步移的方法和5'RACE的方法，测得了全长为11545个核苷酸的SCRV基因组序列。五个基因及非编码区的结构排列为：3' Leader-N-P-M-G-L-Trailer5'。其中M基因含有两个独立的互不重叠的开放阅读框(open reading frame，ORF)，大的ORF编码M蛋白，小的ORF编码一个4.5 kDa的未知蛋白(暂称为Ms)，而Ms在已知的所有弹状病毒基因组中都不存在，并且在GenBank库中未搜到同源序列。 氨基酸序列比对结果显示：SCRV N、P、M和G蛋白均与鱼类弹状病毒903/87相应蛋白的同源性最高，分别为41.5％、14.8％、25.8％和25.3％。在903/87 L蛋白尚未测出全序列的情况下，SCRV L蛋白显示与人类一种弹状病毒(Chandipura virus，CHPV)L蛋白同源性最高，为44.7％；而与鱼类弹状病毒SVCV的同源性略低，为43.8％。分别构建五个基因的遗传进化树，结果显示SCRV N、P、M和G基因均与903/87相应基因聚为一支，L基因则与SVCV L基因聚为一支。 5、SCRVN基因与M基因的原核表达及其产物在细胞中的分布。分别制备了SCRV N和M基因融合蛋白的相应抗体。western blot分析表明，所制备的抗体能够特异性识别SCRV的N和M蛋白。采用免疫荧光技术对N和M蛋白细胞内的分布进行了检测，结果表明，病毒在细胞内复制时，N和M蛋白分别分布于胞质中及胞膜周围，与哺乳动物弹状病毒相应蛋白在细胞内的分布一致。另外，还测定了兔抗SCRV N蛋白血清的体外抗病毒活性，显示一定时间内，抗血清具有抑制SCRV在GCF细胞中复制的效果。
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