棉酚生物合成研究：相关P450酶系基因的克隆鉴定以及棉籽中棉酚合成的基因工程抑制

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中文摘要：棉花是世界上最重要的经济作物之一，是纺织工业的主要纤维原料来源。棉花的种子中含有丰富的蛋白质、脂肪和碳水化合物，可以是良好的食物和饲料来源。棉花通过在地上部分的腺体和根的表皮层中积累大量棉酚等倍半萜醛类化合物，来保护植物，减少病菌的侵染和昆虫的取食。棉酚属倍半萜醛类化合物。目前已经有一些棉酚合成途径中的基因被分离鉴定，例如法尼基焦磷酸合成酶(FPS)，(+)-δ-杜松烯合成酶[(+)-δ-cadinene synthase]，(+)δ-杜松烯-8-羟化酶[㈩-δ-cadinene-8-hydroxylase，CYP706B1]等，但8-羟基杜松烯形成后的酶促反应步骤尚不清楚，相应的酶还没有被克隆分析。由于棉酚的化学结构中含有多个羟基，因此我们推测还有多个细胞色素P450参与了棉酚的合成。细胞色素P450单加氧酶是一类重要的蛋白，它们参与植物体内多种化合物的合成与分解代谢。通常P450不能直接催化底物的氧化，它们的催化活性需要细胞色素P450还原酶(CPR,E.C.1.6.2.4)的参与。为了便于对棉酚合成途径中的细胞色素P450进行功能分析，我在本文论文工作中首先分离了棉花(Gossypium hirsutum)的两个细胞色素P450还原酶，分别命名为GhCPR1和GhCPR2。GhCPR1和GhCPR2之间的蛋白序列等同性为71％，与其他植物的CPR也具有较高的蛋白相似性(65％-80％)。原核表达纯化的CPR蛋白能够催化细胞色素c(cytochrome c)、铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和DCPIP(Dichlorophenolindophenol)的还原反应。这些酶促还原反应都依赖NADPH提供电子，并且可被黄素蛋白的抑制剂DPI(Diphenyleneiodonium)抑制。另外，它们也能够支持肉桂酸-4-.羟化酶(cinnamate4-hydroxylase，CYP73A25)的催化活性。GhCPR1和GhCPR2在棉花各组织中都有表达，其中GhCPR1表达水平较高，而GhCPR2表达水平较低。GhCPR1在有酚棉和低酚棉之间表达水平差异不大，而GhCPR2在低酚棉中有一定的下调。当棉花受到机械损伤和大丽轮枝菌激发子处理时，GhCPR2的表达受到强烈诱导，而GhCPR1表达水平没有变化，暗示GhCPR2可能与棉花的防御反应以及次生代谢关系更加密切。为了分离鉴定棉酚合成途径中其他细胞色素P450单加氧酶，从棉花的EST数据库中挑选出13条编码P450基因的ESTs。通过RT-PC震分析了它们的表达特征，筛选出一个既在有酚棉和低酚棉叶片中显著差异表达，又能被大丽轮枝菌激发子强烈诱导的P450。通过5'和3'RACE得到了该基因的全长eDNA，命名为CQl。CQl全长1797bp，编码一个523氨基酸残基的蛋白，与CYP82家族序列同源性较高，可能代表了该家族一个新的亚家族。在一些棉酚含量较高的品种和组织中，CQ1的表达水平较高；而在低酚棉和棉酚含量较低的组织中CQ1的表达水平很低。在种子发育过程中，随着棉酚开始积累，C01的转录本水平也迅速上升。另外，大丽轮枝菌激发子和机械损伤也能够强烈诱导CQ1的表达。这些表达特征与棉花体内棉酚的积累和目前已知的棉酚合成途径基因的表达模式高度一致，说明CQ1很可能是棉酚合成途径中的新P450基因。棉花植株含有的棉酚类化合物对植物具有重要的保护作用，而种子中的棉酚却使棉籽的利用受到很大限制。为了降低棉籽的棉酚含量而不影响植株其他部分棉酚类化合物的含量，根据杜松烯羟化酶基因序列，构建了由种子特异启动子驱动的双链RNA(dsRNA)载体并转化了棉花。在T0代棉花种子中，部分棉籽的棉酚含量显著降低，CYP70681的转录本水平也明显下调。从T1代群体中，筛选出两株(1个株系)植株棉酚含量变化不大、种子棉酚几乎检测不到的转基因棉花，为低酚棉育种提供了新的种质资源。

作者：

杨长青

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关键词：

次生代谢棉酚 P450还原酶生物合成基因克隆细胞色素P450 转基因棉花

授予学位：

博士

学科专业：

遗传学

导师：

陈晓亚

学位年度：

2009

学位授予单位：

中国科学院上海生命科学研究院

语种：

中文

中图分类号：

Q94