Geobacillus sp α-淀粉酶基因的克隆、表达、酶学性质研究及分子进化

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中文摘要：α-淀粉酶(1,4-α-D-葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)能够以淀粉为底物，从淀粉内部水解1,4-α-D-葡萄糖苷键，广泛应用于淀粉糖生产、发酵、纺织、造纸等行业，具有巨大的经济价值。本研究用稀释分离法从广西象州温泉筛选分离到一株可水解淀粉的中度嗜热细菌GXS1,该菌株革兰氏染色为阳性，端生芽孢，细胞呈杆状，最适生长温度为60℃-65℃，最适生长pH为6.0-7.0。结合生理生化特征和16SrRNA基因序列分析，初步鉴定该菌株为Geobacillus sp.GXS1。用聚合酶链反应(PCR)技术，从Geobacillus sp.GXS1中扩增出α-淀粉酶基因，在大肠杆菌中高效表达，SDS-PAGE电泳结果显示，有相对分子质量为53kD的特异性蛋白表达条带。用金属镍亲和层析将重组蛋白进行分离纯化，所得纯化酶用DNS法酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为65℃、7.0，Km值为2.93mg/mL，比活力为353.95U/mg，Tm为75℃。金属离子Cu2+、Fe33+、Fe2+、Zn2+、Co2+、Hg2+、Ag+及金属鏊合剂EDTA对酶活有显著抑制作用，Mn2+、Ba2+对酶活有微弱的抑制作用，K+、Ca2+、Mg2+、巯基乙醇对酶活有微弱的激活作用，而其它一些离子如Na+、Li+对酶活影响不大。HPLC分析表明G.sp.GXS1α-淀粉酶可水解淀粉产生葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的混合物，对α、β环糊精基本不起作用。利用定点饱和突变对Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因进行改造，首先是借助计算机根据Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因的同源建模三维结构信息，利用ProSa2003软件根据能量(knowledge-based potentials)最低化原则，计算机辅助设计确定Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶基因氨基酸饱和突变位点，通过同源建模分析表明192D、221E和289D三个位点都是活性中心位点。利用兼并引物对192,221,289位点的氨基酸分别进行饱和突变，筛选到四个有活力的突变D192A、E221N、E221L和D289L。对突变酶进行酶学性质的研究表明D192A的最适温度、最适pH、米氏常数、比活力和Tm分别为65℃、7.0、3.41mg/mL、28.39、269.78U/mg、75℃；突变酶E221N的最适温度、最适pH、米氏常数、比活力和Tm分别为65℃、7.0、3.84mg/mL、370.64U/mg、77℃；突变酶E221L的最适温度、最适pH、米氏常数、比活力和Tm分别为70℃、6.5、2.66mg/mL、318.25U/mg、77.5℃；突变酶D289L的最适温度、最适pH、米氏常数、比活力和Tm分别为60℃、7.0、4.34mg/mL、170.45U/mg、73.5℃。

作者：

薛蓓

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关键词：

α-淀粉酶基因表达基因克隆酶学性质分子进化

授予学位：

硕士

学科专业：

微生物学

导师：

韦宇拓

学位年度：

2009

学位授予单位：

广西大学

语种：

中文

中图分类号：