摘要
目的：克隆C57BL/6小鼠重组甘丙肽基因，构建其过表达转基因载体，为制作转基因动物奠定实验基础。 方法：用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)分别克隆C57 BL/6小鼠甘丙肽基因cDNA与第二内含子DNA片段，然后用PCR对二者进行重组，得到Galanin-intron2片段。Galanin-intron2与人的血小板源性生长因子B链(platelet-derived growth factor Bchain，PDGF-B)基因启动子共同克隆至pSP73载体，Galanin-intron2位于PDGF-B启动子下游，构建C57 BL/6小鼠甘丙肽过表达转基因载体pSP73-PDGFB-Gal-intron2。 1.从健康成年C57BL/6小鼠大脑组织中提取总RNA和基因组DNA;在GenBank中查询已知的甘丙肽基因序列，用软件Primer5.0设计特异引物；通过逆转录PCR(ReverseTranscription-PCR，RT-PCR)扩增出甘丙肽cDNA序列；通过普通PCR扩增出甘丙肽基因5'端非编码cDNA序列(5'Non-coding Region，5'NCR)、3'端非编码cDNA序列(5'Non-codingRegion,3'NCR)及第二内含子(itron2)。以cDNA和5'NCR的PCR产物混合物为模板，通过重叠延伸PCR(Overlap Extension PCR，OE-PCR)扩增甘丙肽外显子1-2(exon1-2)；以cDNA和3'NCR的PCR产物混合物为模板，OE-PCR扩增甘丙肽基因外显子3-6(exon3-6)；以exon1-2，exon3-6及itron2 PCR产物混合物为模板，经OE-PCR扩增本次实验所需的甘丙肽目的基因片段Galanin-intron2。 2.Galanin-intron2 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳胶回收纯化，再经加A反应后，通过T-A克隆于pGEM-easyT载体，酶切后经电泳鉴定及DNA测序，命名为pGEMT-Gal-intron2。 3.HindⅢ与XhoⅠ酶切pGEMT-Gal-intron2得到Galanin-intron2片段，XbaⅠ与HindⅢ酶切psisCAT6α质粒得到PDGF-B启动子，XbaⅠ与XhoⅠ酶切pSP73载体，将Galanin-intron2片段与PDGF-B启动子连接入pSP73载体，命名为pSP73-PDGFB-Gal-intron2。 结果：获得带有重组甘丙肽基因的pGEMT-Gal2质粒和甘丙肽转基因表达载体pSP73-PDGFB-Gal-intron2，酶切后经电泳鉴定及测序，与GenBank中的序列一致。 结论：1.实现了甘丙肽基因的体外人工重组。2.通过T-A克隆获得带有重组甘丙肽基因的质粒pGEMT-Gal-intron2。3.获得甘丙肽转基因表达载体pSP73-PDGFB-Gal-intron2。
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