摘要
目的：设计合成死亡素基因，在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式进行表达，并分离纯化产物，为进一步研究死亡素的抗菌活性及应用价值打下基础。 方法： 1、根据文献报道的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，设计thanatin基因序列，并在两端加入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，然后合成该基因的两条单链，复性为双链。 2、将该基因用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后与同样双酶切的pUC18连接、转化感受态DH5a，通过蓝白斑筛选挑选阳性菌落，抽提重组质粒，酶切、PCR鉴定后，测序验证。 3、将克隆重组体与表达载体pGEX-4T-1分别酶切，二者连接后转化感受态BL21，挑选阳性重组子，抽提重组质粒，酶切、PCR鉴定后，测序验证。 4、将鉴定正确的重组表达质粒转化感受态BL21，经IPTG37℃诱导表达，进行全菌体蛋白SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达情况。收集阳性表达的BL21，使用GST融合蛋白纯化试剂盒裂解包涵体，纯化融合蛋白，用凝血酶对融合蛋白进行切割分离。 结果： 1、合成了目的基因的两条单链，并复性为双链。 2、将目的基因克隆到pUC18上，初步检测、筛选阳性转化子，并测序，结果表明与预先设计的基因序列一致，克隆重组质粒构建成功。 3、构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-thanatin，初步检测、筛选阳性转化子，进一步测序正确，可以进行诱导表达。 4、诱导表达后，SDS-PAGE电泳可见约29kD的融合蛋白条带，说明目的基因得以融合表达；裂解包涵体，纯化、溶解融合蛋白，凝血酶切割得到含死亡素的混合液。 结论：死亡素基因转化大肠杆菌经诱导表达获得融合蛋白，对融合蛋白进行初步纯化、分离，得到了含有死亡素的混合液，尚需进一步纯化。
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