摘要
目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达抗菌肽Dermaseptin S46串联体，并对其进行纯化和鉴定。为进一步研究抗菌肽Dermaseptin S4结构与功能的关系奠定基础。 方法： 1.根据抗菌肽Dermaseptin S4的氨基酸序列及真核生物偏爱密码子，推出Dermaseptin S4编码基因的序列，并将Dermaseptin S4基因通过连接肽(GATAGGTAGCG)将六个基因片段连接在一起，形成Dermaseptin S46串联体基因，并在六串联体的两侧分别加上了Xbal和SalⅠ的限制酶切位点，设计出目的基因，并通过化学合成方法将Dermaseptin S46串联体基因合成。 2.将抗菌肽基因Dermaseptin S4六串联体克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFASTBac1载体中，构建了重组转座载体pFASTBac6Dermaseptin S4，抽提重组质粒测序鉴定。 3.将鉴定正确的重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，经蓝白筛选，挑取阳性重组菌落，抽提重组质粒以通用引物RV作为引物进行PCR鉴定。 4.获得重组成功的Bacmid DNA，并转染昆虫草地夜蛾(Bombyx mandafina)St9细胞出现病变后，收集含有重组病毒颗粒的培养上清，重新感染草地夜蛾SD单层细胞，收集SD细胞培养上清和细胞再进行SDS-PAGE及Western blot5.用ProBondTM纯化系统(Invitrogen公司产品)采用非变性条件对抗菌肽Dermaseptin S4蛋白进行纯化。 结果： 1.重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定，证明成功构建了pFASTBac6Dermaseptin S4质粒。 2.12％聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的目的蛋白带，分子量大小为27000，与理论值相符，灰度扫描显示，表达量约占细胞总蛋白的20.1％.Western blot显示目的蛋白均具有良好的反应原性。 结论：成功构建了抗菌肽Dermaseptin S46串联体，并在昆虫细胞中经杆状病毒表达系统得到成功表达，并进一步对目的蛋白进行了纯化，为下一步蛋白结构与功能的关系奠定基础。
NETL