本课题以21日龄断奶杜长大仔猪为试验对象,研究日粮添加谷氨酰胺对断奶仔猪不同阶段生长性能、免疫功能的影响,并在此基础上,从肠道消化酶、组织切片观察,内分泌水平探讨谷氨酰胺促生长的机理,运用细胞生物学和分子生物学等实验方法,从组织DNA含量,体外T淋巴细胞增殖分化,免疫指标的基因表达等方面来探讨谷氨酰胺改善断奶仔猪免疫功能的机理。 选择120头21日龄断奶杜长大仔猪,随机分4组,每组设3个重复,每个重复10头。其中1组为对照组;另3组为试验组,日粮中分别添加0.5%;1%;1.5%谷氨酰胺,按NRC营养需要,并根据等氮等能原则调整试验组日粮配方。试验期为21天,全期自由采食和饮水,断奶前取6头,并在断奶后,10,20天,对照组和1%谷氨酰胺组每组再取6头,供水进食12小时后进行屠宰取样,分析测定相关指标。获得以下主要结果: 1、谷氨酰胺对仔猪早期生长性能的影响 饲养试验结果表明:试验组在第9天后腹泻率明显下降,到第12天腹泻基本停止;而对照组在整个过程中的腹泻率较高,断奶8-11日龄一直维持50-60%的腹泻率;并且腹泻延续的时间较长,断奶12-15日龄仍有20-30%的腹泻率。 断奶1-10日龄,0.5%、1.0%和1.5%谷氨酰胺组料重比分别比对照降低了14.00%(P＜0.05)、12.05%(P＜0.05)、9.13%(P＞0.05),各组日增重差异不显著,但谷氨酰胺对日增重有提高的趋势。断奶11-20日龄,试验各组日增重分别比对照组提高了21.39%(P＞0.05)、27.75%(P＜0.05)和12.72%(P＞0.05),试验组日平均采食量比对照组分别提高了4.89%(P＞0.05)、12.70%(P＞0.05)、9.77%(P＞0.05),各组的料重比相近。 断奶10日龄,1.0%试验组血清尿素氮水平比对照组降低了17.36%(P＞0.05),断奶20日龄血清尿素氮水平比对照组降低了4.26%(P＞0.05)。断奶10日龄,谷氨酰胺对血清总蛋白水平无明显影响,断奶20日龄试验组血清总蛋白水平比对照组提高了18.70%(P＞0.05)。日粮谷氨酰胺对血清白蛋白水平无明显影响。日粮添加谷氨酰胺对T3,T4水平无明显影响;但生长激素水平有一定的提高,断奶10日龄、20日龄分别比对照组提高了12.18%(P＞0.05)、14.93%(P＞0.05)。 2、谷氨酰胺对小肠消化化酶及形态结构的影响 断奶10日龄,对照组和1%试验组总蛋白水解酶活性,糜蛋白酶活性分别比断奶前下降了8.248%(P＞0.05)、4.63%(P＞0.05),和32.42%(P＜0.05)、27.26%(P＜0.05)。试验组与对照组的两种酶活性无显著差异。胰蛋白酶活性比断奶前高,试验组比对照组提高比对照组提高了12.83%(P＜0.05)、16.31%(P＞0.05)、26.0896(P＜0.05)。 断奶10日龄,1%试验组十二指肠肠壁固有层厚度、空肠绒毛高度和皱褶深度较对照组差异显著(P＜0.05),其中空肠绒毛高度较对照组差异极显著(P＜0.01)。断奶20日龄,试验组十二指肠绒毛高度、肠壁固有层厚度;空肠绒毛高度和皱褶深度较对照组差异显著(P＜0.05),其中十二指肠绒毛高度、空肠绒毛高度和皱褶深度较对照组差异极显著(P＜0.01)。 3、谷氨酰胺对仔猪免疫功能的影响 血清免疫指标:断奶10日龄,对照组IgG、IgM水平比断奶前降低了17.94%(P＞0.05)、31.26%(P＜0.05),1%谷氨酰胺试验组IgG、IgM水平比断奶前降低了11.43%(P＞0.05)和13.69%(P＞0.05),对照组和试验组血清IgA水平比断奶前提高了20.31%(P＞0.05)、28.13%(P＜0.05)。断奶10日龄时,1%试验组血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM分别比对照组高了6.49%(P＞0.05),7.94%(P＞0.05)和25.56%(P＜0.05);血清补体C3含量较比照组高38.57%(P＜0.05);血清IL-2,IL-6含量分别比对照组提高了23.81%(P＜0.05),36.36%(P＜0.05)。 断奶20日龄,1%谷氨酰胺试验组IgA、IgG、IgM分别比对照组提高了8.06%(P＞0.05)、11.13%(P＜0.05)和11.93%(P＜0.05);血清补体C3含量较对照组提高了25.61%(P＞0.05);血清IL-2,IL-6含量分别比对照组高31.92%(P＜0.05),66.67%(P＜0.05)。T淋巴细胞的增殖分化率结果显示,对照组和试验组增殖率分别为16.52%、28.92%,组间差异显著(P＜0.05)。1.0%谷氨酰胺试验组肠系膜淋巴结和空肠黏膜的DNA含量分别比对照组提高了9.18%(P＜0.05)、12.59%(P＜0.05)。 肝脏抗氧化酶活性和淋巴组织细胞因子含量: 断奶10日龄时,1%谷氨酰胺试验组肝脏GSH-Px酶活力比对照组提高了11.87%(P＜0.05),SOD酶活力比对照组降低了6.93%(P＞0.05);试验组肠淋巴组织细胞因子IL-2,IL-6含量分别比对照组提高了10.39%(P＞0.05),11.68%(P＞0.05)。 断奶20日龄,1%谷氨酰胺组SOD酶活力比对照组降低了9.5496(P＞0.05),GSH-Px酶活力比对照组提高了9.56%(P＜0.05);试验组肠淋巴组织细胞因子IL-2,IL-6含量分别比对照组提高了13.14%(P＜0.05),8.33%(P＞0.05)。 4.仔猪肝脏SOD、GSH-Px和淋巴细胞IL-6基因克隆 本试验根据已报道的肝脏SOD、GSH-Px和淋巴细胞IL-6基因序列设计特异性的引物,对肝脏SOD、GSH-Px和淋巴细胞IL-6基因片段进行了克隆。对测序结果进行序列分析表明,得到的肝脏SOD、GSh-Px和淋巴细胞IL-6基因片段序列与Genebank登陆号分别为E06791、AF532927和M80258的基因片段同源性均达到99%。 5.RT-PCR方法研究谷氨酰胺对仔猪SOD、GSH-Px,淋巴细胞IL-6基因表达的影响 本试验构建了优化的PT-PCR反应体系,各基因最适PCR反应条件为:SOD,Mg2+浓度1 mmol/L,循环数31;GSH-Px Mg2+浓度1.5 mmol/L,循环数29;IL-6 Mg2+浓度2 mmol/L,循环数29。 研究结果显示,日粮中添加1%谷氨酰胺时,断奶仔猪肝脏SOD基因表达量较对照组减少。在断奶10日龄和20日龄,仔猪肝脏SOD mRNA表达量分别降低了47.94%(P＞0.05)和77.02%(P＜0.05)。 日粮中添加1%谷氨酰胺,断奶仔猪肝脏GSH-Px基因表达量增加。与对照组相比,断奶10日龄和20日龄,仔猪肝脏GSH-Px mRNA表达量分别提高了73.16%(P＜0.05)和28.27%(P＞0.05)。 日粮添加中1%谷氨酰胺,可以提高断奶仔猪淋巴细胞IL-6基因表达量。在断奶10日龄和20日龄时,仔猪淋巴细胞IL-6 mRNA表达量分别比对照组提高了200.1%(P＜0.05)和136.18%(P＜0.05)。 本研究结果显示:(1)日粮添加谷氨酰胺可以降低仔猪断奶腹泻率,缩短腹泻期,提高断奶仔猪日增重。(2)日粮添加谷氨酰胺能缓解断奶仔猪在十二指肠和回肠的黏膜萎缩,显著提高断奶仔猪十二指肠、空肠的绒毛高度,提高空肠黏膜的DNA含量,促进仔猪断奶后小肠黏膜的恢复。(3)日粮添加谷氨酰胺可显著提高断奶仔猪十二指肠内容物胰蛋白酶的活性,提高仔猪的蛋白消化能力。(4)谷氨酰胺在早期断奶的仔猪免疫系统中发挥重要作用,日粮添加谷氨酰胺可以显著促进断奶仔猪T淋巴细胞分化,显著提高肠系膜淋巴结的DNA含量,显著提高断奶仔猪的血清TgA、IgG、IgM水平,日粮添加谷氨酰胺调节了GSH-PxSOD IL-6基因mRNA的表达量,进而影响仔猪机体免疫相关指标,如血清抗体、肝脏抗氧化物酶活性和淋巴组织细胞因子含量,增强了断奶仔猪免疫力。
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