摘要
本研究目的: 1.探索星形胶质细胞与乏氧组织分布的关系； 2.研究脑梗死后乏氧组织的动态变化与星形胶质细胞的关系。 3.研究脑梗死后乏氧组织的持续时间与星形胶质细胞的关系。 实验过程: 1、实验动物： 健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠43只，体重280～330g，清洁级，人工昼夜节律饲养。 2、缺血再灌注模型的制作： 参照Longer氏法，稍加改良。到缺血预定观察时间点后，将栓线拉回到ECA的主干中，从而实现再灌注。持续缺血组不拔线。假手术组不插线，其余操作同上。 3、实验分组： 分3组：1.5h缺血再灌注(1.5h IR)组、持续缺血(PI)组和假手术组(S组)；1.5hIR组和PI组再分术后1d、3d、7d、14d四个亚组，每个亚组5只大鼠。S组共3只大鼠。 4、EF5和GFAP的免疫双标： 乏氧标记采用乏氧标记物2-(2-nitro—lH—imidazole-1-yl)—N—(2，2，3，3，3-pentafluoropropyl) Acetamide(简称EF5)，由美国宾夕法尼亚大学的Cameron J Koch教授馈赠。采取胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)标记活化的星形胶质细胞。 1.5h IR组和PI组：在每个观察时间点，每只大鼠以EF5溶液(生理盐水溶解，3mg/ml)按1ml/100g体重的剂量从尾静脉注射进体内，4h后心脏灌注，迅速开颅取脑；OCT包埋后，以视交叉为中心间断连续冰冻切片，每隔0.5mm切一张片，每个组织共5张片。切片以4％多聚甲醛固定后，依次以0.3％TritonX100和10％山羊血清处理；以GFAP多克隆一抗(1：200稀释，由武汉博士德生物技术公司提供)4℃孵育过夜，ttPBS和PBS浸泡后再以FITC标记的二抗(1：50稀释，由武汉博士德生物技术公司提供)室温、避光孵育2h；接着以4％多聚甲醛室温、避光重新固定20min，ttPBS和PBS浸泡，以10％山羊血清重新封闭1h；ttPBS和PBS浸泡后，以Cy3标记的ELK3-51避光、4℃孵育过夜。ttPBS和PBS浸泡后，50％甘油封片。荧光显微镜下观察。乏氧组织呈红色荧光，GFAP呈绿色荧光。 S组不需静脉注射EF5溶液，仅进行GFAP染色。 5、组织分区： 将梗死侧大脑半球的周围皮质区依次分为A、B、C三个区(图2)，显微镜下以×200的倍数进行观察。 6、图像分析及GFAP荧光强度计算方法： 利用Adobe Photoshop CS2专业图形分析软件对双标的乏氧图片和GFAP染色图片进行重叠(图层合并)。利用Image Pro Plus6.0专业图像分析软件对GFAP染色图片进行荧光强度计算。 7、统计学分析： 采用SPSS for Windows Ver．11.5统计软件包对数据进行统计学处理。结果用(-X±s)表示，P<0.05认为有统计学意义。 结论： 1、乏氧组织内部星形胶质细胞活化较周围区域明显，乏氧可能促进星形胶质细胞活化。 2、脑梗死后乏氧组织的长时间存在与星形胶质细胞密切相关。
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