摘要
研究背景： 癫痫是脑部神经元高度同步化异常放电所致，以发作性、短暂性、重复性及刻板性为特征的的一组中枢神经系统功能失常综合征。神经元胞膜兴奋性增高，易于形成痫性放电，是癫痫发生的病理生理基础。电压门控钠离子通道的结构和功能异常可引起神经元的膜兴奋性改变，在癫痫的发病机制中具有重要作用。目前初步推测电压门控钠离子通道的改变以及其调控蛋白的变化，均可能参与这一机制。 哺乳动物电压门控钠离子通道组成孔区的α亚单位可由同一家族的9个基因编码，其中Nav1.1和Nav1.6在中枢神经系统表达。对特发性全面性癫痫，如全面性癫痫伴热性惊厥附加症，婴儿重症肌阵挛癫痫的相关研究发现：α亚单位Nav1.1编码基因SCNIA的突变，导致持续钠电流增加，提高神经元兴奋性参与癫痫的发生机制。而且，VGSC是多种常见抗癫痫药物的作用靶点。因此VGSC的改变导致神经元放电模式变化可能参与癫痫的发病机制。 最近对于实验动物和人类的获得性颞叶内侧癫痫的研究提示获得性癫痫也可能因为钠通道的表达改变，导致功能的变化，出现钠电流的异常。海马NaV1.1的mRNA的水平在匹罗卡品和红藻氨酸模型大鼠未见明显改变，但是人类颞叶内侧癫痫手术标本的原位杂交提示NaV1.1的mRNA水平升高。匹罗卡品诱导癫痫持续状态大鼠海马齿状回颗粒细胞NaV1.6的mRNA水平在急性期和慢性自发癫痫形成期均见明显降低，而点燃模型的研究发现海马CA3区神经元的NaV1.6的mRNA和蛋白水平均持续升高。因此有必要对获得性颞叶内侧癫痫模型海马CA1区进行mRNA和蛋白水平的观察进一步了解该蛋白表达的变化。 锚蛋白重复序列家族是一个结合体蛋白的家族，含有数量不等的ankyrin重复膜体(，把各种膜相关蛋白和细胞质中的蛋白定位在细胞膜的特异性区域上，因结合的胞浆蛋白不同产生不同的生物学效应。细胞膜锚蛋白基因ANK2突变导致一组遗传性心律失常综合征，提示离子通道病变以外的原发性心律失常的发病机制。对于同样是可兴奋性细胞的神经元相关的兴奋性改变，也可能与这一和离子通道相关联的蛋白的改变有关。Nav1.6的膜内结合蛋白锚蛋白—G的膜结合结构域可调节Nav1.6的持续钠电流。但是在获得性癫痫动物模型中尚未见其表达及功能的改变的报道。 综上所述，电压门控钠离子通道α亚单位NaV1.1和NaV1.6以及其调节蛋白ankyrin—G在获得性颞叶内侧癫痫形成机制中的作用和机制有待进一步研究。 研究目的： 通过检测NaV1.1和NaV1.6的表达随着颞叶内侧癫痫形成的时程和空间分布改变，了解颞叶内侧癫痫形成是否与NaV1.1和NaV1.6的表达改变相关；通过同步检测Ankyrin—G表达的改变，了解在颞叶内侧癫痫形成中Ankyrin—G是否影响NaV1.1和NaV1.6的表达；通过检测颞叶内侧癫痫模型海马神经元钠电流的电生理学变化，从功能上求证钠电流改变在颞叶内侧癫痫形成中的作用。 研究方法： 1.匹罗卡品诱导癫痫持续状态大鼠模型的建立和鉴定 SD大鼠(6-8周，雌性)随机分成匹罗卡品组、假处理组和空白对照组。匹罗卡品组依次注射氯化锂、丁溴东莨菪碱、匹罗卡品诱发癞痫持续状态，60min后注射地西泮终止发作。假处理组大鼠在相应时间点注射同等体积生理盐水替代匹罗卡品，其余操作与处理组相同。同龄空白对照组不给予上述药物。处理组大鼠被诱发急性发作后接受行为学观察和脑电监测。各组在处理后1天和60天各选取5只SD大鼠进行病理学检查，经多聚甲醛固定后取海马行冰冻切片，进行尼氏染色。 2.荧光实时定量逆转录PCR检测目标基因表达量 根据大鼠大脑体视学图谱(Paxinos and Watson，1986)，使用12号针头连接针管在解剖显微镜下抽取海马CA1区组织。在玻璃匀浆器中加入海马CA1区脑组织和RNAiso Reagent Trizol研磨，提取总RNA。逆转录cDNA后进行荧光实时定量逆转录PCR检测SCNIA，SCN8A和ANK—3。内参为β—actin，选择Pfaffl法进行定量分析。 3.Western blotting检测目标蛋白表达水平 同上方法抽取海马CA1区组织，提取蛋白后检测蛋白浓度，进行Western blotting实验。电泳转膜后分别使用NaV1.1、NaV1.6、ankyrin—G和内参β—actin的抗体孵育，然后孵育相应二抗，曝光显影后对条带进行定量分析。 4.免疫荧光双标检测目标蛋白共表达水平 前述冰冻切片同时孵育NaV1.6和ankyrin—G的抗体以及相应二抗，在荧光显微镜下观察，并对阳性神经元进行计数。 5.膜片钳检测钠电流特征 急性分离海马CA1区神经元，在全细胞电压钳模式下给予标准刺激方案，根据所得电流数据建立快速钠电流的激活曲线、失活曲线和失活后复活曲线，计算持续钠电流的最大波幅和激活电压，进行比较。 6.统计学分析 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，统计方法用SPSS13.0 for Windows软件包(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行统计分析，采用t检验、two way ANOVA和one—way ANOVA。P<0.05，具有统计学意义。 研究结果： 1.匹罗卡品诱导癫痫持续状态大鼠模型的建立和鉴定 急性期匹罗卡品组大鼠出现Racine分级的Ⅳ级或以上发作。慢性自发癫痫形成期可见每周2～6次的自发癫痫发作。脑电图检测：PISE组大鼠给药前基线脑电背景波幅在30-60μV之间，频率在6-18Hz之间；急性期可见低于6Hz的慢活动逐渐增多，可见爆发长程出现的尖活动、棘活动和不规则的尖慢复合活动；慢性自发癫痫形成期，可见背景活动中出现较多散在的频率低于6Hz的慢活动和散在出现的棘波、多棘波和棘慢复合波。假处理组和空白对照组大鼠在两个相应时间点脑电监测与PISE组大鼠给药前基线脑电监测所见相似。尼氏染色见PISE组匹急性期CA1区大量锥体细胞紧密排列，排列整齐，形态完整，胞浆内存在丰富的尼氏小体，仅见少量坏死神经元；慢性自发癫痫形成期见锥体细胞排列紊乱，投射纤维方向不一，胞浆内尼氏小体减少，部分细胞形态不完整，细胞肿胀或者皱缩，轮廓模糊、界限不清，部分神经元缺失导致锥体细胞层中断。 2.海马CA1区NaV1.1和NaV1.6表达的变化 分期和分组对于SCN1A的的mRNA水平未见显著性影响。急性期PISE组SCN8A的mRNA低于假处理组和同龄空白对照组，但差别无显著性意义(P>0.05)；慢性自发癫痫形成期PISE组SCN8A的mRNA水平比假处理组升高41.08％(P<0.001)，与同龄空白对照组相比升高30.88％(P=0.011)。慢性自发癫痫形成期PISE组NaV1.6的蛋白水平比假处理组升高66.63％(P<0.001)，与同龄空白对照组相比升高73.88％(P=0.011)。PISE组慢性自发癫痫形成期NaV1.6蛋白的平均水平比急性期增高12.08％(P=0.022)。 3.海马CA1区ankyrin—G表达的变化 慢性自发癫痫形成期PISE组ANK—3的mRNA水平比假处理组升高19.76％(P<0.001)，与同龄空白对照组相比升高35.05％(P<0.001)。PISE组ankyrin—G的蛋白水平比假处理组升高70.21％(P<0.001)，与同龄空白对照组相比升高63.83％(P<0.001)。 4.海马CA1区NaV1.6和ankyrin—G共表达的变化 慢性自发癫痫形成期，PISE组双染阳性神经元的平均水平较假处理组升高60.80％，差异有统计学意义(P<0.001)，与同龄空白对照组相比升高66.15％，差异有统计学意义(P<0.001)。而且，PISE组大鼠慢性自发癫痫形成期海马CA1区双染阳性神经元较急性期增高62.90％，差异具有统计学意义(P<0.001)。 5.海马CA1区神经元钠电流的变化 持续状态后急性期和慢性自发癫痫形成期PISE组大鼠海马CA1区神经元短暂钠电流的激活曲线较假处理组及空白对照组左移，失活曲线右移，差异无统计学意义。慢性自发癫痫形成期PISE组持续钠电流的电流幅度较同龄对照组明显增高(P<0.05)。 结论： 1.本研究首次在匹罗卡品诱导癫痫持续状态的SD大鼠海马CA1区发现电压门控钠离子通道α亚单位NaV1.6表达水平在慢性自发癫痫形成期增高，进一步的电生理研究提示与该蛋白相关的持续钠电流在模型慢性自发癫痫形成期增强，提示其参与动物模型获得性颞叶内侧癫痫的形成机制。 2.本研究首次在匹罗卡品诱导癫痫持续状态的SD大鼠模型上进行海马CA1区锚蛋白ankyrin—G表达水平的研究，发现在慢性自发癫痫形成期该蛋白表达较急性期以及同龄对照组增高，提示ankyrin—G可能参与该动物模型获得性颞叶内侧癫痫的形成过程中神经元胞膜稳定性变化的调节。 3.本研究通过实时荧光定量逆转录多聚酶链反应和免疫印迹方法从mRNA和蛋白水平证实电压门控钠离子通道α亚单位NaV1.1在匹罗卡品诱导癫痫持续状态的SD大鼠海马CA1区表达水平无改变，并且通过短暂钠电流的电生理学特性研究证明其功能的稳定性。
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