摘要
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是定植于胃粘膜表面的革兰氏阴性、生长缓慢的螺旋状微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因子，并且与胃癌和胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。Hp的致病性已得到公认，但其致病的机制及感染结局的多样性的本质仍未阐明。近年来，人们开始将寻找Hp致病特异基因的目标投向其“可塑区”。jhp947基因是位于J99可塑区上的基因，国外文献报告jhp947基因是Hp的一种新的致病因子，与胃癌、消化性溃疡等疾病关系密切。因此，本研究通过比较jhp947基因缺失突变株及其相应野生株J99菌株的主要毒力活性差异及其对宿主细胞增殖、凋亡和分泌细胞因子的影响，初步评价与Hp可塑区jhp947基因相关的生物学作用及其在细胞水平的毒性以及对细胞因子IL-8、IL-12分泌的影响，为揭示jhp947基因参与Hp致病过程的分子机制，探索其与消化性溃疡、胃癌的相关性提供实验依据。 方法： 1、jhp947基因缺失突变株J99-947△的主要毒力活性检测。 1.1应用尿素酶试剂，检测947基因敲除突变株J99-947△与标准株J99的尿素酶活性差异。 1.2采用0.3％半固体琼脂穿刺法比较突变株与标准株的移行能力差别。 1.3采用体外细胞(GES-1细胞)粘附实验检测突变株与标准株的粘附作用差异。 1.4突变株和标准株培养上清以不同滴度作用于GES-1细胞，镜下观察细胞空泡样变，并结合中性红摄入法定量检测各组空泡毒素活性。 2、J99-947△对GES-1细胞增殖与凋亡的影响。 2.1标准株、突变株分别与GES-1细胞共培养48h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。 2.2 CCK-8比色法检测标准株、突变株与GES-1细胞共培养24h，对细胞增殖活性的影响。 2.3流式细胞仪检测标准株、突变株与GES-1细胞共培养24h的细胞凋亡情况。 3、J99-947△对细胞因子IL-8、IL-12分泌的影响。 3.1标准株、突变株分别与AGS细胞共培养24h后，收集上清测定IL-8。 3.2从正常人外周血中分离培养鉴定树突状细胞。 3.3标准株、突变株分别与未成熟树突状细胞共培养48h后，收集上清测定IL-12。 3.4标准株、突变株分别与THP-1单核细胞共培养24h后，收集上清测定IL-12。 结果： 1、jhp947基因缺失突变株J99-947△的主要毒力活性。 1.1尿素酶活性标准株组和突变株组在细菌与尿素酶试剂作用后，即刻会引起明显的颜色变化，两组均在20min即分解完全尿素酶试剂达到最大吸光度值，两组在5-30min4个时点的吸光度值均无明显差异(p>0.05)，提示jhp947基因缺失对Hp尿素酶活性没有影响。 1.2 Hp移行能力在0.3％半固体布氏平板上培养3d后，标准株从穿刺位点处向周围区域扩散开(平均直径10.3±1.0mm)，突变株形成菌落集群平均直径(9.5±1.3mm)，二者差异无统计学意义(p>0.05)，提示jhp947基因缺失对Hp移行能力没有影响。 1.3 J99和J99-947△均能粘附于GES-1细胞表面，在MOI为100:1，粘附2h后细胞周围粘附的细菌数分别为65±18、58±15，两者之间差异无统计学意义(P>0.05)，提示jhp947基因缺失对J99对细胞的粘附能力没有影响。 1.4标准株J99组和突变株J99-947△组空泡试验阳性的滴度均为1:8，且空泡形成的特点相近。进一步结合中性红摄入法定量评价空泡毒素活性，结果发现，947基因敲除突变株与其亲本野生株的空泡毒素活性没有明显差别，提示947基因敲除并不影响VacA活性。 2、J99-947△对胃上皮细胞株GES-1细胞增殖和凋亡的影响。 2.1幽门螺杆菌标准株组J99对GES-1细胞具有损伤作用，随着作用时间的延长。GES-1细胞形态由贴壁的梭形变为圆形，细胞核染色质浓缩，呈新月形聚集于核缘，细胞质浓缩，可见空泡变性，死亡细胞逐渐增多。突变株组细胞也出现与标准株组类似的细胞形态学变化。 2.2 CCK-8试验显示，Hp与细胞共培养24h后，MOI为2:1，4:1，标准株和突变株组均对GES-1细胞有促增殖作用，当MOI为4：1时，标准株和突变株组对GES-1细胞的促增殖作用最为明显，具有统计学意义(p<0.05)。而标准株组与突变株组组之间差别无显著性(p>0.05)。 2.3流式细胞分析显示，在攻击细胞，标准株和突变株均可引起细胞凋亡，凋亡率分别为15.3％和14.2％，均高于对照组凋亡率1.7％(p<0.05)，但两实验组差别无统计学意义。 3、J99-947△对细胞因子IL-8、IL-12分泌的影响。 3.1标准株组和突变株组均导致AGS细胞分泌IL-8水平显著提高(p<0.05)，但两实验组差别无统计学意义(p>0.05)。 3.2本实验成功地从正常人外周血中诱导、扩增获得大量imDCs和mDCs，并从形态结构、表面分子表达及功能状态三方面加以综合鉴定。 3.3标准株组和突变株组均导致树突状细胞分泌IL-12水平显著提高(p<0.05)，而突变株组致树突状细胞分泌IL-12水平较标准株组分泌IL-12水平显著下降(p<0.05)。 3.4标准株组和突变株组均导致THP-1细胞分泌IL-12水平显著提高(p<0.05)，而突变株组致THP-1细胞分泌IL-12水平较标准株组分泌IL-12水平显著下降(p<0.05)。 结论： 1、jhp947基因缺失对Hp主要毒力活性包括尿素酶活性、移行能力、粘附能力、空泡毒性均无明显影响。 2、突变株J99-947△对胃上皮细胞株GES-1细胞增殖和凋亡的影响与标准株J99无明显差异。 3、首次发现jhp947基因与Hp刺激树突状细胞、单核细胞分泌炎症细胞因子IL-12有关。
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