摘要
目的： 艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)引起的免疫缺陷性疾病，Trabattoni等发现HIV感染者T细胞、B细胞、单核细胞B7-H1表达与疾病进展密切相关，有效HAART治疗显著降低病毒血症患者B7-H1的表达水平，还有研究显示，B7-H1/PD-1可抑制HIV病毒特异性T细胞增殖和细胞因子分泌。中国人群的遗传背景不同于国外人群，B7-H1表达水平与HIV感染疾病进展的相关性研究国内外少见报道，尚无对于同一患者B7-H1及其配体同时检测的研究，探讨B7-H1/PD-1抑制途径与效应T细胞功能降低之间的的关系，将为阐明HIV感染效应T细胞免疫耐受的可能机制及临床免疫治疗提供新的思路。 材料和方法： 1、研究对象： 36例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者均来自中国辽宁，其中男性22例，女性14例，年龄分布为19-58岁(39.17±10.64)，所有患者均经Genelab公司蛋白印迹试剂盒确认为HIV抗体阳性。根据HIV感染时间和CD4+T细胞数量将上述患者分为HIV组(CD4+T细胞≥200个/μl，无艾滋病指征性疾病)和AIDS组(CD4+T细胞<200个/μl或出现艾滋病指征性疾病)。36例HIV/AIDS患者中HIV组21例、AIDS组15例。健康对照组为20例随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人，性别、年龄均与HIV/AIDS患者匹配，平均年龄为27-52岁(38.1±7.61)，其中男性11名，女性9名。所有研究对象无菌采静脉血5ml(EDTA抗凝)，并在抽血留样前均签署知情同意书并进行了相关问卷调查。 2、标本采集： 用EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉血5ml，在6小时内进行试验。 3、CD4+T淋巴细胞绝对计数T淋巴细胞绝对值： 依据1997年美国CDC关于HIV感染者CD4+T细胞检测指导方法，应用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式细胞仪MULTISET软件检测。将20μlCD4/CD8/CD3TRITEST试剂加入绝对计数管中，经反向加样法加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。 4、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞： 离心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液14ml，沿管壁缓慢加入用PBS稀释后的抗凝全血30ml，离心400g，30min。用移液管吸取界面层的PBMC，移入另一离心管中。加入5倍体积的PBS缓冲液，洗细胞2次。 5、外周血B7-H1/PD-1表达检测： 树突细胞表面B7-H1表达水平流式检测：向2支流式管中各加入2×106HIV感染者及健康人PBMC，每管加入下列荧光标记的组合单抗：①Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、IgG1-PE各20ul，②Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、B7-H1-PE各20ul，混匀后4℃避光染色30分钟，用PBS洗涤后加入含1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析，计算mDC表面B7-H1表达的百分率。mDC的表面特征性标志为CD11chighHLA-DR+Lin1-。 T淋巴细胞B7-H1和PD-1表达水平检测：向3支流式管中各加入1×106HIV感染者及健康人PBMC，每管加入下列荧光标记的组合单抗：①CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、IgG1-PE各10ul，②CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、B7-H1-PE各10ul③CD3-PerCP、CD4-APC-cy7、CD8-FITC、PD-1-PE各10ul，混匀后4℃避光染色30分钟，用PBS洗涤后加入含1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。 6、病毒载量检测 以200μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor1.5commercialkit在COBASAMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。检测范围为400-750，000copies/ml。HIV-1感染者的病毒载量转化为以10为底的对数用于统计学分析。 7、统计分析 所有资料采用SPSS11.5软件分析。数据以均值±标准差表示，符合正态分布的数据采用单因素方差分析，并进行均数两两比较，使用Pearson进行相关性分析，不符合正态分布的数据采用Mann-WhitneyUtest进行比较，使用Spearmanrank进行相关性分析，统计概率采用双侧检验，P<0.05时有统计学意义。 实验结果 1、HIV/AIDS患者mDC及不同亚群T细胞B7-H1的表达水平通过检测外周血中B7-H1表达发现，和健康对照相比，HIV/AIDS患者mDC、CD4+、CD8+T细胞B7-H1的表达水平显著增高(P值均<0.05)。其中mDC、CD4+T细胞表面B7-H1的表达在NC、HIV组、AIDS组依次升高，P值均<0.05，HIV组CD8+T细胞表面B7-H1的表达显著高于NC组，P<0.05，AIDS组高于HIV组，但无统计学意义。 2、HIV/AIDS患者不同亚群T细胞PD-1的表达水平和健康对照相比，HIV/AIDS患者CD4+、CD8+T细胞PD-1的表达水平显著增高(P值均<0.05)。其中CD8+T细胞表面PD-1的表达在NC、HIV组、AIDS组依次升高，P值均<0.05，HIV组CD4+T细胞表面PD-1的表达显著高于NC组(P<0.05)，AIDS组高于HIV组，但无统计学意义。mDC表面不表达PD-1。 3、B7-H1/PD-1的表达水平与CD4+T细胞数量的相关性36例HIV/AIDS患者mDC、CD4+T、CD8+T细胞上B7-H1表达的百分率与CD4+T细胞数量呈显著负相关(mDC+B7-H1+:r=-0.647，P<0.001；CD4+B7-H1+:r=-0.489，P=0.002；CD8+B7-H1+:r=-0.372，P=0.026).CD4+T、CD8+T细胞上PD-1表达的百分率与CD4+T细胞数量呈显著负相关(CD4+PD-1+:r=-0.374，P=0.025；CD8+PD-1+:r=-0.455，P=0.005)。 4、B7-H1/PD-1的表达水平与病毒载量的相关性HIV/AIDS患者mDC、CD4+T、CD8+T细胞上B7-H1表达的百分率与病毒载量呈显著正相关(mDC+B7-H1+:r=0.662，P<0.001；CD4+B7-H1+:r=0.426，P=0.01；CD8+B7-H1+:r=0.531，P=0.001)。CD4+T、CD8+T细胞上PD-1表达的百分率与病毒载量呈显著正相关(CD4+PD-1+:r=0.362，P=0.03；CD8+PD-1+:r=0.380，P=0.022)。 结论： 1、HIV/AIDS患者不同疾病进程外周血mDC、CD4+、CD8+T细胞B7-H1及其配体表达水平显著升高。 2、HIV/AIDS患者B7-H1及其配体表达水平与CD4+T淋巴细胞绝对数明显负相关，与病毒载量明显正相关，是疾病进展的标志。
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