摘要
本课题旨在对收集到的禽源大肠杆菌进行耐酶抑制剂β-内酰胺酶(IRBLs)的检测和耐药性分析，来了解在国内禽源大肠杆菌中产IRBLs的类型、分布情况以及对抗菌药物的耐药情况，并通过检测其基因型，来探讨大肠杆菌的耐药特点和机制，从而为兽医临床合理用药、减少耐药的发生及控制耐药基因的传播提供理论依据。2008年5月-2009年12月，本实验室对从河南各地采集的病料进行分离纯化，选择VITEK-32全自动细菌鉴定仪鉴定为大肠杆菌的135株菌株作为受试菌株，采用纸片扩散法（K-B法）测定阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、替卡西林、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢西丁等的抑菌圈直径，对符合耐酶抑制剂β-内酰胺酶耐药表型的菌株用微量二倍稀释法测定其对不同抗菌药物及抗菌药物联合的最小抑菌浓度(MIC)，并用针对其基因的引物进行PCR扩增全序列，将PCR产物测序，使用Blast软件在Genbank中检索比较。耐酶抑制剂TEM型β-内酰胺酶基因的引物为：IRTU:5’-ATGAGTATTCAACATTTCCG-3’，IRTL:5’-CTGACAGTTACCAATGCTTA-3’。 结果表明，K-B纸片法共筛选出对阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦耐药、头孢唑啉敏感的菌株20株，微量肉汤稀释法测定他们对不同抗菌药物的耐药情况分别为：对阿莫西林、氨苄西林及其与酶抑制剂联合的复方制剂耐药，这与K-B法结果一致。哌拉西林的耐药率较低，为55%，其与三唑巴坦的复方药物的耐药率仅为20%。对氟苯尼考、庆大霉素、新霉素耐药率高达100%，对多西环素的耐药率为95%。对头孢吡肟、阿米卡星、磷霉素、亚胺培南/西司他丁、黏菌素敏感，敏感率为100%。对左氧氟沙星和头孢曲松的敏感率为75%，对环丙沙星的敏感率为65%，对头孢噻肟的敏感率为90%。PCR扩增结果为15株扩增出IRT全序列，PCR产物经纯化、克隆后测序，对序列结果分析表明，14株的PCR产物的核苷酸序列编码的蛋白质与TEM-1100%相同，只有1株产一种新酶，为耐酶抑制剂β-内酰胺酶，已提交序列HM036340与GenBank上公布的AF062386(IRT-28)序列同源性为98%，核苷酸序列中有2个突变点，其中，A139→C这个位点的突变未引起氨基酸突变，属于沉默突变，而G426→T这个位点的突变引起了相应的氨基酸发生变化G128→S（甘氨酸→丝氨酸），此基因的氨基酸序列变化国内外尚未见报道，故将该序列暂命名为IRT-28V。
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