摘要
胃蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族中专门水解蛋白质中疏水性氨基酸残基的肽链内切酶,在鱼体内起着重要的生理和消化功能。在低温下仍然具有高活性的鱼体胃蛋白酶对食品加工、鱼类饵料配置具有重要意义。但是,迄今为止国内外对淡水鱼胃蛋白酶的报道较少。本研究以淡水黄鳝和欧洲鳗鲡为材料,通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析以及Sephacryl S-200、Superde×75凝胶过滤层析等方法分别从黄鳝胃内纯化得到四种胃蛋白酶原,从欧洲鳗鲡胃内纯化得到三种胃蛋白酶原,并对相应酶的性质进行了比较分析。本研究为胃蛋白酶的开发利用提供了实验依据,并为这两种极具经济价值鱼类的消化生理研究打下基础。主要内容包括： ⑴胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体,在酸性条件下酶原从N端失去30-50个氨基酸残基片段后转变成活性酶的形式;SDS-PAGE显示纯化得到的四种黄鳝的胃蛋白酶原(PG-Ⅰ,PG-Ⅱ,PG-Ⅲ(A)及PG-Ⅲ(B))的分子量为36,36,36和35 kDa;相应的四种胃蛋白酶(P-Ⅰ,P-Ⅱ,P-Ⅲ(A)及P-Ⅲ(B))的分子量分别为32,32,31和32 kDa;欧洲鳗鲡的三种胃蛋白酶原(PG-Ⅰ,PG-Ⅱ和PG-Ⅲ)和相应的胃蛋白酶(P-Ⅰ,P-Ⅱ和P-Ⅲ)的分子量分别约为36,30;37,30;37和30 kDa。 ⑵以酸变性牛血红蛋白为底物,四种黄鳝胃蛋白酶的最适pH分别为3.5,3.0,3.0和3.0,最适温度分别为40,40,35和35℃;欧洲鳗鲡三种胃蛋白酶的最适pH分别为3.5,2.5和2.5,最适温度分别为40,40和35℃。来自这两种鱼的胃蛋白酶都属于酸性蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶),pepstatin是它们的有效抑制剂,但抑制效果略有不同。四种黄鳝胃蛋白酶对酸变性牛血红蛋白的Km值和Kcat分别为:1.2×10-4mol/L,23.2 s-1;8.7×10-5mol/L,24.0 s-1;6.9×10-5mol/L,42.6s-1;8.8×10-5mol/L和25.9 s-1;Kcat/Km值依次是1.9×105mol-1·L·s-1,2.8×105mol-1·L.s-1,6.1×105mol-1·L·s-1以及3.0×105mol-1·L·s-1。三种欧洲鳗鲡胃蛋白酶对酸变性血红蛋白的Km值和Kcat分别为:8.8×10-5mol/L,23.7 s-1;9.2×10-5mol/L,19.4 s-1;7.0×10-5mol/L,和34.4 s-1;Kcat/Km依此是2.7×105mol-1·L·s-1,2.1×105mol-1·L·s-1和4.9×105mol-1·L·s-1。 ⑶用大鼠抗黄鳍鲷PG-Ⅰ,PG-Ⅱ,PG-Ⅲ和PG-Ⅳ多克隆抗体作为一抗,分别与四种黄鳝胃蛋白酶原做Western blot,结果显示黄鳝PG-Ⅲ(A)和PG-Ⅲ(B)均能与四种多抗发生强烈的免疫交叉反应,而黄鳝PG-Ⅰ和PG-Ⅱ不能与大鼠抗黄鳍鲷PG-Ⅲ发生免疫交叉反应,与另外三种多抗可以发生免疫交叉反应;欧洲鳗鲡PG-Ⅱ,PG-Ⅲ均能与四种多抗发生免疫交叉反应,PG-Ⅰ只与抗黄鳍鲷PG-Ⅰ,PG-Ⅱ多克隆抗体发生免疫交叉反应而不与大鼠抗黄鳍鲷PG-Ⅲ和PG-Ⅳ多克隆抗体发生免疫交叉反应。
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