摘要
目的： 随着海拔升高，大气中的氧含量逐渐减少，生活在低海拔哺乳动物暴露于高海拔环境时会发生高山病。而世居于海拔3000-5000 m高寒地区的牦牛（Bosgrurnniens）在生理、生化和形态学上已获得了适应高原低氧的稳定遗传学特性，对低氧环境显现出了良好的适应性，没有发生高山病。这种适应性是由遗传因素所决定的，即牦牛的肺脏对这种低氧环境有相应的适应性结构。因此，本文首次通过多种组织化学方法、透射电镜技术及免疫组织化学技术对不同年龄牦牛肺脏支气管系进行一系列的研究，阐明不同年龄牦牛肺脏支气管系的结构特点，为探讨牦牛对高原低氧的适应性机理提供形态学依据。 方法： 采集胎牛肺脏（妊娠7-8月龄，用于免疫组化）、犊牛（1-3日龄）、幼龄牦牛（5-6月龄）和成年牦牛（3-5岁龄）左肺尖叶和膈叶相同部位的组织样品，分别制作光镜和透射电镜切片。（1）使用苏木素-伊红染色法、过碘酸雪夫氏反应、阿利新蓝染色法、Verhoeffe's Van gession染色法、Grimileus氏嗜银染色法和甲苯胺蓝染色法对牦牛肺脏的基本结构，支气管上皮中的纤毛细胞、杯状细胞、Clara细胞和粘膜下腺体，以及弹性纤维、平滑肌和肥大细胞的分布进行研究；（2）通过Image-Pro Express软件测量和计算支气管管径的大小、上皮的高度、上皮中每100μm基膜长度上杯状细胞和Clara细胞的数量、单位面积内神经内分泌细胞和神经上皮小体的密度、支气管中平滑肌的厚度、气管和支气管软骨的厚度及外膜的厚度；（3）观察各级支气管和细支气管上皮细胞超微结构及特点；（4）应用免疫组织化学方法研究肺内神经内分泌细胞和神经上皮小体在不同年龄牦牛肺脏的形态、数量及分布特点。 结果： 1.牦牛肺内支气管呈不对称二叉分支，即分支支气管与主干支气管间夹角大，偶见三叉分支形式。各级支气管管径随年龄的增加而逐渐增大，随各支气管分支的出现而逐渐减小。支气管上皮高度也随年龄的增加而逐渐增高，伴随各级分支的出现上皮高度也逐渐降低，其中以主支气管上皮最高（犊牛：29.77±9.96μm；幼龄：40.27±10.39μm；成年：41.18±9.48μm），依次逐级逐渐降低，到呼吸性细支气管时达最低（犊牛：8.37+2.08μm；幼龄：8.17±1.98μm；成年：8.92±3.09μm）。对支气管管径大小和上皮高度变化的比较研究发现，各年龄段牦牛肺内各级支气管管径大小的变化明显大于支气管上皮高度的变化，并且这种变化在成年组大于幼龄组和犊牛组。 2.本实验定量统计和分析了不同年龄牦牛肺脏支气管上皮中杯状细胞、Clara细胞和神经内分泌细胞及神经上皮小体的数量及分布。其特点如下： 各年龄组中，杯状细胞分布在气管、各级支气管和细支气管中，其中以气管和主支气管中较多，各级分支支气管中次之，细支气管中最少，且各年龄组之间有减少趋势。在终末细支气管和呼吸性细支气管中均未观察到杯状细胞。 Clara细胞于细支气管中开始出现，主要分布在终末细支气管和呼吸性细支气管上皮中，其中以后者最多（犊牛:15.3±5.0个/100μm；幼龄:14.7±3.8个/100μm；成年:13.9±2.6个/100μm），且各组之间随年龄增大呈减少趋势。 神经内分泌细胞随机分布在整个肺脏，尤其以支气管上皮和肺间质中较多。神经上皮小体通常出现在各级支气管分支的开口处。经神经元烯醇酶染色观察发现，神经上皮小体的密度在新生犊牛中达到最高（29.1±5.1/c㎡）到成年牦牛显著减少（5.5±1.9/c㎡）；单个的神经内分泌细胞的密度在胎牛肺脏中达最高（285.8±17.6/c㎡）到成年时降低到最低（111.7±39.1/c㎡）。在各年龄段中，大约55-60％的神经内分泌细胞分布在各级支气管和细支气管中。经嗜铬素A免疫染色观察发现，神经上皮小体的密度在胎牛肺脏中达最高（16.8±2.9/c㎡）到成年显著减少（3.4±0.93/c㎡）；单个神经内分泌细胞的密度也在胎牛肺脏中达最高（229.2±24.8/c㎡）到成年时显著减少到最低（71.0±20.4/c㎡）。此外，在各年龄段大约60％的神经内分泌细胞分布在支气管和细支气管中。对牦牛肺内神经内分泌细胞的形态和分布研究发现，不同年龄牦牛肺内神经内分泌细胞的分布与年龄呈显著的相关性变化，即随年龄的增加其数量呈减少趋势。 3.大多数纤毛细胞胞质致密，胞核呈长椭圆形，线粒体丰富，滑面内质网发达，胞质中偶见粗面内质网和少量空泡样结构。另一类纤毛细胞胞质电子密度低，线粒体丰富，可见大量空泡样结构和扩张的滑面内质网。二者均含有大量糖原颗粒，偶见有高尔基体和溶酶体。 4.牦牛肺内杯状细胞具有典型的特征：胞核呈锯齿状；胞质电子致密，可见成束的粗面内质网；大量的致密膜包裹的黏液颗粒，颗粒呈圆形或卵圆形，不相融合，通常含有一个电子密度低的核心；糖原丰富，偶见高尔基复合体。偶有杯状细胞胞质内含大量空泡样结构和扩张的内质网。粘膜下腺体中的粘液细胞与气管上皮中杯状细胞的结构相似，胞质中也充满带核的分泌颗粒。 5.Clara细胞呈圆顶状，通常突向支气管腔。胞质中含有大量的滑面内质网、粗面内质网和分泌颗粒，也可见若干典型的“缝隙”样结构和许多糖原颗粒出现。 6.粘膜下腺体中浆液性细胞也可分两种类型：一类胞质中充满许多圆形膜包裹的致密分泌颗粒，有发达的粗面内质网、许多线粒体和少量其它细胞器；另一类胞质中富含线粒体和扩张的粗面内质网，分泌颗粒与前一类相似。在各级支气管上皮中均未发现有浆液性细胞出现。 7.本实验也采用一系列组织化学方法对牦牛支气管粘膜下腺体和上皮杯状细胞分泌的粘液特性进行了研究。结果显示，支气管上皮杯状细胞和粘膜下腺体主要分泌中性粘液、酸性粘液和少量的硫酸粘液物质。在终末细支气管和呼吸性细支气管上皮中未发现有粘液分布。 结论： 1.牦牛肺内支气管呈不对称二叉分支，偶见有三叉分支。支气管管径随年龄的增加逐渐增大，随各级支气管分支的出现而逐渐减小。支气管上皮高度也随年龄的增加而逐渐增大，随各级分支的出现上皮高度逐渐减小，且各年龄段牦牛肺脏各级支气管管径大小的变化明显大于各级支气管上皮高度的变化，并且在成年组大于幼龄组和犊牛组。 2.本文首次对牦牛支气管系上皮内的杯状细胞、Clara细胞和神经内分泌细胞进行了定量统计。牦牛肺内各级支气管上皮中杯状细胞的分布随年龄的增大及支气管管径的减小呈逐渐减少趋势；Clara细胞主要分布在远端支气管，且随管径减小呈逐渐增多趋势；不同年龄牦牛肺脏神经内分泌细胞的分布与年龄呈显著的相关性变化，即随年龄的增加而减少，且差异显著。 3.支气管系中纤毛细胞的两种形态；杯状细胞中带核的分泌颗粒；Clara细胞中分泌颗粒的形态及缝隙样结构和浆液性细胞的两种类型是牦牛不同于其它动物支气管系上皮的重要特点。 4.支气管上皮杯状细胞和粘膜下腺体主要分泌中性粘液和酸性粘液，其中还有少量的硫酸粘化液物质；终末细支气管和呼吸性细支气管上皮中未发现有粘液分布。
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