摘要
本论文第一部分是有关小麦叶绿体转基因技术。与核转基因相比，叶绿体转基因具有许多优点，包括：外源基因高效表达、可以同时表达多个基因、安全性好、避免基因沉默现象和位置效应、可以直接表达原核基因、可以实现定位整合，后代遗传稳定等。叶绿体转基因技术被看作是“环境友好型”的生物技术。迄今为止，叶绿体转基因技术已成功应用于许多双子叶及少数单子叶植物，例如：烟草、番茄、马铃薯、拟南芥、油菜、莴苣、矮牵牛花、水稻等。然而，作为世界重要粮食作物之一的小麦，至今还未成功实现其叶绿体遗传转化，限制了该技术在小麦遗传改良中的应用。 制约该技术应用于单子叶禾本科农作物的主要原因有：在通过幼胚诱导的愈伤组织中，前质体尚未发育成绿色叶绿体，体积小，难以转化；前质体基因表达调控与成熟叶绿体具有很大差别；禾本科作物叶片的反复再生较为困难，极大限制了叶绿体转基因植株同质化。 本实验首次以小麦为材料，对小麦叶绿体转基因前期组培技术以及同质化技术等关键技术进行研究，以期克服小麦组培方法带来的障碍，初步探索其叶绿体遗传转化，为今后小麦叶绿体基因工程育种打下基础。论文在以下几个方面取得了进展： 1.建立了小麦叶绿体转基因受体材料的诱导和继代技术。对小麦幼胚愈伤组织培养体系进行研究，确定了济南177(JN177)和中国春(CS)两种小麦组织培养合适的接胚时间、继代周期，明确了愈伤组织状态与胚性的关系。幼胚的大小、状态对于将来胚性愈伤组织的诱导及继代十分重要，继代过程中应尽量挑选黄色致密的胚性愈伤组织进行继代。在用小麦愈伤组织作为叶绿体转基因的受体材料时，应尽量使用继代培养1～6个月之内的愈伤组织，以保证较高的再生频率。 2.建立了小麦试管苗幼叶反复再生技术，为开展小麦叶绿体转基因同质化研究奠定了重要的技术基础。这是国内外首次通过再生苗叶片实现试管苗的二次再生。己申请国家发明专利(申请号200910230815.8)。通过实验比较发现，再生苗高度4cm左右时截取其叶片基部的l～2mm叶段进行愈伤组织诱导，愈伤组织诱导培养基添加2mg/L2，4-D和lmg/L NAA，分化培养基添加10mg/L AgN03和lmg/LTIBA时两种小麦具有最好的愈伤组织诱导率和二次再生率。 3.初步建立了小麦愈伤组织的转绿技术。经过特殊培养基的诱导培养，最终获得了既具有胚性细胞特征又包含叶绿体的小麦绿色愈伤组织，这在国内外尚属首次。获得的绿色愈伤组织为开展小麦叶绿体转基因提供了良好的受体材料。 4.研究了转化体的筛选技术。已经确定适用于小麦叶绿体转化体的筛选剂种类与浓度，建立了转化体筛选的相关技术，发现100mg/L链霉素具有较好的再生苗筛选效果，而愈伤组织继代筛选的最初浓度为200mg/L链霉素较合适。 5.尝试进行了小麦叶绿体的转化。通过基因枪法对小麦愈伤组织进行叶绿体转化，然后通过抗生素筛选，获得了一定数量的抗性苗并移栽。 本论文第二部分是木质素相关糖基转移酶基因克隆。木质素是一类芳香族聚合物，是构成植物细胞壁的主要成分之一。目前，对其生物合成途径较为清楚，如改变合成途径中的关键酶，就能改变木质素含量及H/G/S三种类型木质素之间的比例。 木质素单体在细胞质内合成，但其聚合却发生在细胞膜外，它们是如何跨膜运输到膜外至今缺乏研究。相关研究表明糖基转移酶能改变其底物的跨膜运输。最近在拟南芥中发现一个小的基因簇，其产物能糖基化木质素单体，这为木质素单体的跨膜运输提供了一种假设。杨树木质纤维是生物质能源工业和造纸业的重要原料，为了研究杨树木质素合成调控机理，本论文首次预测并克隆了杨树的木质素单体糖基转移酶相关基因，为进一步研究杨树木质素合成调控机理奠定了基础。论文在以下方面取得了进展。 1.通过序列同源性比较，预测了杨树木质素单体相关的4个糖基转移酶基因。 2.通过RT-PCR从毛白杨中扩增并克隆了相应基因的cDNA。 3.构建了这4个预测基因的原核表达载体和植物表达载体。
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