摘要
肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性进行性致死性神经系统变性疾病,其病因和发病机制尚不清楚。很多研究表明氧化应激介导了神经元的死亡并在神经变性疾病的发生发展中发挥着重要作用,因此抗氧化应激治疗相应地成为了治疗ALS的一个重要方向。 有研究发现在ALS患者的神经组织中存在异常的TDP-43(TAR-DNAbinding protein)蛋白阳性包涵体,并出现该蛋白从核内到核外的异常分布。TDP-43由位于人类1号染色体1p36.2上的TARDBP(transactive responseDNA binding protein)基因的6个外显子编码。TARDBP基因序列高度保守,广泛表达于多种组织。 在后续的研究中证实,TDP-43在基因的表达调控方面起着重要作用,包括:参与剪切囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因及载脂蛋白AⅡ(ApoA-Ⅱ)基因;通过富含甘氨酸的C末端与核内不均一糖核蛋白(hnRNP)家族成员结合从而影响外显子跳跃接拼(exon skipping)、抑制剪接活性;与运动神经元生存蛋白作用为核体提供支架;参与调节mRNA稳定性、microRNA的生物合成、细胞凋亡和分裂;可能是调节神经元可塑性的神经元活性反应因子等。 近两年来,数个研究小组先后在不同人群的家族性ALS(familial ALS,FALS)和散发性ALS(sporadic ALS,SALS)患者中发现了TARDBP基因的30多种突变,尤其以TDP-43Q331K与散发性ALS和TDP-43M337V与家族型ALS的相关关系研究较多,种种证据都提示TARDBP基因的异常与ALS的发生发展可能潜在相关,因此对这一基因功能及致病机制的研究也逐步深入。 本实验室已做的研究证实,在转染TDP-43 Q331K、M337V突变位点的运动神经元细胞系(motor neuron-like cell line,简称NSC34)出现比转染Empty vector、TDP-43 Wide type组显著的氧化损伤、线粒体功能的障碍。 白藜芦醇(Resveratrol,简称Res)最早是由葡萄的皮和种子中提取的一种植物抗毒素,化学名称为3,4',5-三羟基-1,2-二苯乙烯(亦称芪三酚),是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物,其具有多种生物学活性:如抗氧化作用,神经保护作用,抗肿瘤增殖作用,心血管保护作用,激活延寿基因等作用。研究证实,白藜芦醇上述生物学活性中,最受关注的是抗氧化清除自由基和神经保护作用。 本研究应用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,深入研究不同浓度白藜芦醇对转染TDP-43突变位点的NSC34细胞系的作用。以细胞增殖速度和细胞总体损伤状况为切入点,寻求白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。 目的:探索稳定转染TDP-43的NSC34细胞系的培养方法;利用稳定转染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34细胞系作为ALS的细胞模型,以此模型为基础,研究白藜芦醇干预后细胞的变化,探讨白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞的保护浓度。 方法:参照NSC34细胞细胞株的培养程序,将本实验室现有的稳定转染TDP-43的NSC34细胞系进行复苏、传代、消化、冻存等,观察其生长和增殖变化。在成功培养稳定转染TDP-43的NSC34细胞基础上,于传代24小时后进行换液,待细胞恢复6-12小时后,将细胞分为对照组和Res干预组,Res干预组分别给予Res1、5和25μmol/L,作用24小时,用四甲基噻唑蓝(MTT)法进行细胞活力分析;收集各组培养液,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。 结果:(1)成功培养了稳定转染Empty vector、TDP-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43 M337V四个NSC34细胞系,倒置显微镜下观察细胞生长状态良好;(2)稳定转染TDP-43的NSC34细胞系在给予Res作用24小时后,倒置相差显微镜下观察,1和5μmol/L干预组各组细胞形态可见突起细长光滑,彼此间可见丰富的联系,胞体圆润、折光性强、贴壁能力好;Res25μmol/L干预组可见各组细胞突起短,细胞彼此间多形成聚集,胞体皱缩、折光性差甚至成球形亮点、贴壁能力差;(3)给予Resl、5μmol/L作用24小时后,较未干预组和Res25μmol/L干预组细胞增殖程度明显升高、培养液LDH水平明显下降,具有统计学意义(P＜0.05);(4)给予Res25μmol/L作用24小时后,较对照组和Res1、5μmol/L干预组细胞增殖程度明显降低、LDH明显升高,具有统计学意义(P＜0.05); 结论:进一步探索了稳定转染的四个细胞系作为ALS的体外细胞模型的培养方法;低浓度的白藜芦醇可促进NSC34细胞的增殖,降低培养液中LDH含量,表明低浓度白藜芦醇对转染TDP-43的NSC34细胞起到保护的作用,高浓度的白藜芦醇可以加重TDP-43的NSC34细胞的损伤。本研究为寻求神经变性疾病的治疗新策略提供了依据。
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