摘要
目的： 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化、增殖和向血管内膜迁移是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础。血小板源性生长因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)是体内一种强效促有丝分裂剂,可刺激VSMC从收缩型(分化型)向合成型(去分化型)转化,在细胞的增殖、转化、组织损伤的修复及动脉粥样硬化斑块形成中起重要作用。目前,已知有PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC、PDGF-DD几种类型,可与细胞膜上的PDGF受体(PDGF receptor,PDGFR)结合,参与调节细胞的信号转导分子及转录因子的活性。 Krüppel样因子4(Krüppel-like factor,GKLF/KLF4)是KLFs家族中与胚胎发育、细胞分化和癌症发生密切相关的转录因子。该因子高表达于终末分化或撤血清培养而生长缓慢的细胞中,对多种细胞的研究表明,KLF4具有抑制细胞增殖的作用。本实验用PDGF-BB刺激VSMC,观察对增殖及分化相关基因表达的影响,探讨KLF4与其它转录因子的相互作用,为揭示KLF4在VSMC表型转化中的作用机制提供研究线索。 方法与结果: 1 PDGF-BB对VSMC增殖活性的影响 MTT分析显示,PDGF-BB刺激可显著提高VSMC增殖活性,PDGF-BB的促增殖作用具有剂量和时间依赖性。 2 PDGF-BB对VSMC细胞周期的影响 用10 ng/ml PDGF-BB刺激VSMC24 h后,用流式细胞术检测细胞周期分布,结果显示,与对照组相比,PDGF-BB(10 ng/ml)可明显减少G0/G1期细胞数,升高S期、G2/M期细胞比例,表明PDGF-BB刺激可加速VSMC细胞周期进程。 3 PDGF-BB对VSMC迁移的影响 伤口愈合实验显示,PDGF-BB刺激的VSMC迁移活性是对照组的5.83倍,表明PDGF-BB可促进VSMC迁移。 4 PDGF-BB对VSMC表型标志物表达的差异影响 Western blot结果显示,PDGF-BB可诱导增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)的表达,抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin kinase inhibitor,CKI)p27和分化相关基因平滑肌22α(SM22α)的表达。PDGF-BB诱导的VSMC表型标志物的变化与细胞周期分布特征具有一致关系。 5 PDGF-BB对KLF4表达及磷酸化水平的影响 Western blot结果显示,PDGF-BB可诱导KLF4的表达。用抗磷酸化丝氨酸抗体免疫沉淀细胞裂解液,用抗KLF4抗体检测磷酸化的KLF4水平,结果显示,PDGF-BB作用于VSMC15 min,KLF4磷酸化水平显著增高,90 min达到最高峰,120 min仍维持在较高水平。表明PDGF-BB可上调KLF4的活性。 6 PDGF-BB对KLF4与其他转录因子相互作用的影响 PDGF-BB刺激0、3、6 h的VSMC裂解液用抗KLF4抗体进行免疫共沉淀后,分别用抗NF-κB、抗smad2、抗smad3、抗HDAC2和抗HDAC5抗体进行Western blot分析,发现KLF4能与NF-κB、smad2、smad3、HDAC2相互作用,并且随着时间的延长,KLF4与NF-κB的相互作用增强,而与smad3、HDAC2的结合活性随着时间的延长逐渐减弱。 结论: 1 PDGF-BB促进VSMC增殖和迁移。 2 PDGF-BB上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调增殖抑制蛋白p27、分化相关蛋白SM22α的表达。 3 PDGF-BB诱导KLF4的表达和磷酸化,促进KLF4与NF-κB的相互作用,抑制KLF4与smad3、HDAC2的结合。
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