摘要
研究背景 我国白血病发病率为2.76／10万,在恶性肿瘤死亡率中,白血病居第6位(男性)和第8位(女性),在儿童及35岁以下成人中则居第一位,且近年来发病率呈上升趋势。纵观近40年来急性白血病的治疗进展,尽管60～80％初发白血病患者(非M3)可获得临床完全缓解(CR),但是仍有大于50％的缓解患者在治疗1～2年内复发,体内的白血病细胞对化疗药物出现耐药,导致治疗失败。难治、残留、复发仍然是白血病治疗的巨大障碍和亟待解决的难题。近年来,砷剂在急性早幼粒细胞白血病中的应用为中草药抗肿瘤治疗开创了新纪元,中草药在世界医学中的影响越来越大,开发有效的天然抗肿瘤药物成为肿瘤治疗的热点之一。 青蒿素类衍生物青蒿琥酯(Artesunate ART)能够通过血脑屏障、高效、低毒、脂溶性好、抗疟活性高等特性使之成为世界范围的抗疟疾首选药。目前国内外大量研究表明,其在体内外对多种肿瘤细胞有选择性杀伤作用,而对人体正常细胞作用轻微；且其与已知的传统抗癌化疗药如长春新碱、甲氨蝶呤、羟基脲等作用机制不同,因此可与传统抗癌化疗药物合用。 研究发现ART可在体内外抑制肿瘤血管形成,进而干扰肿瘤微环境,导致肿瘤细胞增殖受抑,但其在分子水平的具体作用机制尚需进一步探讨。Efferth等用55种人源性肿瘤细胞系检测青蒿琥酯的抗癌活性,发现白血病细胞和大肠癌细胞对其最为敏感。进一步文献调研发现,白血病细胞和大肠癌细胞存在一个共同特点,即β-catenin信号通路的表达失调。β-catenin信号转导途径的激活在维系干细胞的增殖、细胞的分化、体轴的发育、细胞的不对称分裂等许多生物发育过程中具有重要作用,随着对其在分子生物学领域作用研究的深入,研究发现β-catenin信号通路在淋巴细胞以及造血干细胞的发育中也具有重要作用,而且越来越多的证据表明这一途径可能与维持白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)的自我更新和增殖分化密切相关。 在本课题组前期工作中,利用基因芯片技术研究了慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者急变期和慢性期基因表达变化,并进一步利用生物信息学对差异表达基因进行数据挖掘,结果发现,wnt信号通路在CML疾病进展过程中扮演了重要角色,其中β-catenin处于CML急变相关基因和转录因子网络调控的核心位置。β-catenin蛋白是一个多功能蛋白,至少存在3种不同的细胞定位,可以发挥两种相对独立的生物学功能。正常细胞中,细胞膜上的β-catenin与E-cadherin相互连接,维持上皮细胞的完整性；胞浆内游离β-catenin水平较低,不能进入细胞核调控癌基因表达。在肿瘤细胞中,胞浆内游离的β-catenjn异常积累,激活下游靶基因如c-myc、CyclinD1等基因转录,启动肿瘤生长程序；另一方面还会直接诱导E-cadherin的表达缺失,从而导致上皮细胞发生上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促进肿瘤细胞转移。 E-cadherin是依赖Ca2+的细胞粘附分子超家族成员之一,表达于骨髓基质细胞和CD34+造血干细胞,介导造血细胞与骨髓基质细胞的相互作用,是骨髓微环境的重要组成部分。细胞膜上E-cadherin的表达缺失能使白血病细胞从彼此的连接中解离、迁移出来,并破坏造血微环境的稳态,使白血病细胞获得侵袭性表型,导致白血病细胞脱离其它细胞的黏附并进一步分散和转移。因此,β-catenin信号通路相关基因是介导白血病细胞与其微环境“crosstalk”的关键网络调控分子之一。 因此我们猜测,青蒿素的抗白血病活性可能与β-catenin信号通路密切相关。有必要深入探讨β-catenin信号通路与白血病发生发展的关系以及青蒿琥酯抗白血病活性是否与β-catenin信号通路相关,为明确青蒿素衍生物的作用机理及临床应用提供实验依据。 研究目的 1.挖掘CML急变相关基因,旨在进一步探讨CML急变机制。 2.检测白血病患者E-cadherin和β-catenin mRNA的相对表达水平,并探讨其临床意义,旨在进一步探讨β-catenin通路相关基因在白血病发生、发展中的作用。 3.检测青蒿琥酯作用前后白血病细胞内E-cadherin和β-catenin蛋白定位的变化以及E-cadherin、β-catenin、c-myc、cyclinD1蛋白的表达变化,初步探讨青蒿琥酯对β-catenin信号通路相关蛋白的影响。为青蒿琥酯应用于临床提供新的实验依据和理论基础。 研究方案 1.应用生物信息学方法挖掘基因芯片数据,探讨CML急变可能涉及到的相关基因和信号通路。 2.应用Realtime-PCR法分别检测75例初诊AML患者、68例ALL患者和20例非恶性血液病(对照组)中E-cadherin和β-catenin mRNA的表达,采用2-Δct法对PCR结果进行计算,分析E-cadherin和β-catenin mRNA表达与患者临床特征和疗效的关系。 3.选取U937、K562和MOLT-4白血病细胞为研究对象,分别设浓度为0、12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／ml、100μg／ml青蒿琥酯作用三种白血病细胞24h、48h和72h,MTT法检测各组OD值,计算、比较各处理组细胞的增殖抑制率,并分别计算IC50值；Hoechst33342染色法观察细胞形态变化；Annexin V／PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡率；以确定青蒿琥酯对LJ937、K562和MOLT-4白血病细胞的最佳处理条件。 4.分别应用半定量RT-PCR检测U937、K562和MOLT-4白血病细胞系E-cadherin基因CDH1的表达,并应用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测CDH1是否处于甲基化状态。 5.浓度为0、12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／ml青蒿琥酯分别作用于U937、K562和MOLT-4细胞48h,应用western-blotting方法检测不同浓度ART作用下三种细胞中E-cadherin、β-catenin、c—myc、cyclinD1蛋白的表达变化,探讨青蒿琥酯对β-eatenin信号通路相关蛋白的影响。 6.分别设浓度为0、12.5μg／ml、25μg／ml、50μg／ml青蒿琥酯作用于U937、K562和MOLT-4细胞48h后,应用激光共聚焦显微镜(LSCM)观察U937、K562和MOLT-4细胞中E—cadherin、β-eatenin蛋白定位的变化。 7.统计方法:应用SPSS 13.0软件对数据分析,E-cadherin、β-catenin mRNA表达在急性白血病患者和对照组不符合正态分布,用中位数描述。急性白血病与对照组、AML各亚型、ALL各亚型与对照组间及两两比较采用非参数检验中的Mann—Whitney U检验；AML各亚型间整体比较采用Kruskal-Wallis H检验；E-cadherin、β-catenin mRNA表达与临床特征之间的关系用spearman相关性分析；E-cadherin、β-catenin基因高表达与低表达组间完全缓解率、难治白血病发生率、1年内死亡率比较用x2检验,1年中位生存时间比较Log rank检验；用Kaplan.Meier法进行生存分析。细胞株E-cadherin、β-catenin表达以(x)+S描述,由于方差齐,多组均数比较采用单因素方差分析,组内多重比较用LSD法。药物处理组及空白对照组细胞在增殖抑制率、凋亡方面的比较由于方差齐,采用单因素方差分析。以P<0.05为有统计学差异。 结论 1.利用DAVID软件对基因芯片筛选的差异表达基因进行功能富集聚类,发现粘附相关分子和。wnt通路与CML急变密切相关,进一步采用Genomatix软件对各类基因集和相应转录因子构建了转录调控网络,可明确找出那些处于核心位置的基因和转录因子,其中β-catenin位于核心位置,表明wnt／β-catenin信号通路参与CML急变。 2.急性白血病患者E-cadherin表达显著低于非恶性血液病患者,β-catenin表达显著高于非恶性血液病患者。 3.E-cadherin、β-catenin基因表达水平与AML患者细胞遗传学预后危险度相关,且与B-ALL患者中BCR／ABL融合基因密切相关；T-ALL患者的E-cadherin表达水平较B-ALL低,β-catenin表达水平较B—ALL高. 4.β-catenin表达水平与AML患者LDH、骨髓原幼稚细胞比例呈正相关,与ALL患者初发WBC数呈正相关,E-cadherin、β-catenin基因表达水平与髓外浸润密切相关；β-catenin高表达组难治性白血病发生率较高。 5.青蒿琥酯能够诱导U937、K562、MOLT-4细胞凋亡,且呈时间和浓度依赖性。 6.E-cadherin在白血病细胞中不表达或极低表达,可能与其启动子区甲基化有关。 7.青蒿琥酯可能通过恢复E-cadhefin蛋白的表达,募集β-catenin从胞浆和胞核向胞膜移位,并下调β-catenin蛋白及其通路靶基因c-myc和CyclinD1的表达,从而抑制白血病细胞增殖,诱导细胞凋亡。
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