摘要
甜菜碱是一种非毒性的小分子渗透调节剂,多种高等植物在盐碱或干旱的环境下在细胞中积累甜菜碱,以维持细胞正常的膨压。在植物中甜菜碱是由胆碱经两步反应生成的,催化第一步反应的酶是胆碱单加氧酶(choline monooxygcnase,CMO)。本实验室的前期工作中分离了辽宁碱蓬CMO基因、CMO启动子,发现CMO启动子(pC:-267～+1bp)是盐诱导启动子,在400mmol/L NaCl条件下处理时,其驱动的GUS基因活性是未经NaCl诱导时的5倍。本文构建了pC启动子驱动CMO基因的植物表达载体,转化烟草,分析pC启动子驱动CMO基因在转基因烟草中的表达及转基因烟草的甜菜碱含量,为胁迫诱导型启动子驱动外源基因的应用奠定了基础。具体工作及结果如下: 利用PCR技术从克隆载体pUCl9-CMO中扩增出约1.3kb的CMO基因编码区,经过酶切、连接,替代表达载体pCAMBIA1301-pC-GUS中的GUS基因获得新的表达载体pCAMBIA1301-pC-CMO。 冻融法将pCAMBIA1301-pC-CMO导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,获得工程菌LBA4404-pCAMBIA1301-pC-CMO。 采用农杆菌介导的叶盘转化法将pCAMBIA1301-pC-CMO、pBI121-CMO(CaMV35S启动子驱动CMO基因)转入烟草,PCR检测获得阳性植株。半定量RT-PCR检测表明,35S-CMO转基因烟草CMO基因的表达量高于pC-CMO转基因烟草；甜菜碱含量检测表明,pC-CMO转基因烟草甜菜碱含量与野生烟草的甜菜碱含量相近或略高于野生烟草的甜菜碱含量,35S-CMO转基因烟草中的甜菜碱含量高于pC-CMO转基因烟草。 100mmol/L NaCl胁迫处理转基因烟草和野生烟草24h后,pC-CMO转基因烟草中CMO基因表达量高于35S-CMO转基因烟草,与此相对应,pC-CMO转基因烟草中甜菜碱含量均提高,而野生型烟草和35S-CMO转基因烟草中的甜菜碱含量基本没有变化,且pC-CMO转基因烟草中甜菜碱含量均高于野生烟草、35S-CMO转基因烟草。说明pC可以驱动CMO基因在转基因烟草中适时表达,从而相应提高甜菜碱含量。
NETL