摘要
目的：传统的中国草药穿心莲内酯（Andrographolide）在科研和临床中已证实拥有很强的抗炎活性及治疗变态反应性的肺部炎症的潜力。在目前的研究中，我们通过测定穿心莲内酯治疗后的小鼠气道反应性、气道及周围炎症细胞程度、免疫荧光与免疫印迹实验中核因子（nuclear factor-кB，NF-кB）在肺组织内的表达，进一步研究是否穿心莲内酯可以抑制变应原诱导的气道炎症、气道高反应性以及对核因子NF-кB/P65在气道及肺组织中表达活性的影响，探讨在此过程中药物作用的机制。方法：选取2月龄健康BALB/c雄性小鼠24只，随机分为对照组，模型组，药物治疗组，每组各8只。乙醚麻醉小鼠后，哮喘组和治疗组小鼠分别在第1天和第8天腹腔内注射加入氢氧化铝凝胶的卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）溶液致敏，对照组仅腹腔注射同等剂量PBS。第15天到第22天，哮喘组及治疗组的小鼠每日用浓度为0.2mg/ml的卵清蛋白溶液滴鼻激发，治疗组小鼠连续7天腹腔内注射剂量按体重5ug/g计算的穿心莲内酯溶液。经乙酰甲胆碱激发24小时后，用无创小鼠肺功能仪器记录小鼠气道的高反应性。处死小鼠后，分离并取下肺组织，取部分肺组织以10％福尔马林固定，石蜡包埋后切成6um的薄片，HE染色光镜下观察肺组织炎症细胞侵润程度。评分标准按照文献[1]根据血管周围、气道周围以及肺间质单核炎症细胞侵润情况不同（分为0-3分），评分后做后续统计。取剩余部分做冰冻肺组织切片，加入NF-кB抗体及生物素二抗孵育，细胞核荧光染色剂定位细胞核后特定波长激发抗原抗体复合物。激光共聚焦显微镜扫描冰冻切片。最后分别在对照，哮喘及治疗组中各称量等量肺组织，液氮冷却，快速研磨加入适量RIPA裂解液，电动匀浆后，4度10000转离心30分钟后收集上清液加入EP管中。BCA法测定三组蛋白浓度，计算后各加入适量2X SDS，等量上样。蛋白样品加入10％的SDS-PAGE电泳凝胶中，80V浓缩胶、100V分离胶电泳1.5小时。15V恒压30分钟半干转至硝酸纤维素上。3％的牛血清蛋白37度下封闭一小时，加入1:300的兔抗多克隆抗体NF-кB/P65，4度冰箱过夜。FBST漂洗NC膜10min×2次。.加入单克隆山羊抗兔二抗，37度孵育1.5小时，TBST洗涤10min×2次。NC膜上加适量发光剂暗室内反应约1分钟后，放入柯达4000MW成像仪（美国产），曝光后保存条带。结果：1.一般行为观察实验造模期间，对照组小鼠毛色光泽，行为敏捷，乙酰甲胆碱诱导哮喘不敏感，没有明显的喘息表现。哮喘组随着吸入乙酰甲胆碱剂量加大出现四肢挠抓，躁动不安，伴有呼吸加速，腹部内陷起伏等呼吸困难症状。穿心莲治疗组亦出现以上症状，但频率较哮喘组少，症状较轻。2.穿心莲内酯对小鼠气道高反应的影响根据Fine Point软件分析的图表结果，我们可以得出以下结论。①给予PBS的对照组的小鼠，增强呼气间歇（Enhancedpause，Penh）值在低浓度乙酰甲胆碱的激发下基本没有改变，气道反应性随着乙酰甲胆碱浓度升高而略有上升。②哮喘组模型小鼠有很明显的气道高反应性，Penh数据值与对照组相比较P<0.05，具有统计学意义。③治疗组的penh曲线值要低于哮喘组，但高于对照组，与哮喘模型组相比较P<0.05，有统计学意义。3.穿心莲内酯对变应原引起的小鼠气道炎症的影响取小鼠肺组织HE染色，镜下观察发现①对照组小鼠的肺组织中的细支气管周围、血管及肺间质中仅有极少量炎症细胞浸润。②哮喘组肺组织切片示支气管、肺间质血管周围炎症单核细胞浸润程度是最广泛的，尤其是嗜酸性粒细胞的浸润。③经穿心莲治疗组的小鼠，其气道炎症范围及细胞浸润程度要较哮喘组减少，P<0.05具有统计学意义。但是治疗组的气道炎症范围及细胞浸润程度与对照组相比仍比较明显，P<0.01。4.穿心莲内酯对气道上皮细胞中NF-кB的活性的影响小鼠经变应原激发后，NF-кB因子迅速的从气道上皮细胞质转移至细胞核。在激光共聚焦显微镜下观察①对照组小鼠的免疫荧光实验显示细支气管周围细胞内，仅有极个别细胞存在荧光标记红染的NF-кB核因子。②哮喘模型组的气道上皮细胞呈现出明显的紫色荧光（蓝染的细胞核与细胞内红染的NF-кB颜色叠加）。③经穿心莲治疗组的气道上皮细胞内仅显示少量重叠的紫色荧光。这些图片表明，穿心莲内酯可以干扰NF-кB在细胞核内的激活。5.穿心莲内酯对肺组织内NF-кB蛋白表达水平的影响实验还采用蛋白免疫印迹的方法，半定量检测小鼠肺组织中的NF-кB蛋白的表达。对照组的NF-кB的蛋白条带最淡，哮喘组的NF-кB蛋白条带明显增粗，治疗组的蛋白条带处于两者之间。所以我们推断经穿心莲内酯治疗组的小鼠可以抑制气道上皮细胞及肺组织中NF-кB的活性。结论：1.通过小鼠腹腔内注射及OVA连续滴鼻激发，成功制备了小鼠哮喘模型和经穿心莲内酯治疗变态反应气道炎症的小鼠模型。2.穿心莲内酯可以抑制小鼠气道高反应哮喘组模型小鼠penh值远远高于对照组和治疗组。经治疗后的小鼠penh曲线值要低于哮喘组，P<0.05。所以我们推断穿心莲内酯可以减少变应原诱导的气道高反应。3.穿心莲内酯可以部分抑制变应原诱导的气道炎症反应哮喘组肺组织HE染色示支气管，肺间质，血管周围炎症浸润程度是最广泛的（如噬酸性粒细胞）浸润。经穿心莲治疗后的小鼠，气道炎症范围及细胞浸润程度受到一定的抑制，根据评分标准统计P<0.05，但是与治对照组仍比较明显P<0.01。实验所得数据显示穿心莲内酯仅能部分抑制变应原诱导的气道炎症。4.穿心莲内酯可以抑制气道上皮细胞及肺组织中NF-кB/P65的活性激光共聚焦显微镜下观察组织免疫荧光切片，治疗组肺组织中的NF-кB在细胞核内表达低于哮喘模型组。免疫印迹实验中治疗组NF-кB蛋白的蛋白表达量低于哮喘组。所以我们推断穿心莲内酯可以抑制起到上皮细胞中NF-кB的活性。
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