滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠Wnt信号传导的影响

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中文摘要：目的：通过体内实验和体外实验，从对成骨细胞具有重要调控作用的Wnt信号通路传导的角度，揭示滋阴补肾法治疗糖皮质激素性骨质疏松症的作用机理，并为阐明中医“肾主骨”机理的科学内涵提供进一步的实验依据。方法： 1.体内实验：将55只雌性Wistar大鼠随机分为4组：正常对照组12只、模型组15只、阳性对照组13只、滋补肾阴组15只。模型组大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g体重，给药浓度为1mg/ml，给药剂量为1mg/kg体重，每周2次，连续8w；正常对照组则相应肌注等体积的生理盐水。阳性对照组及滋补肾阴组除按以上方法肌注地塞米松外，阳性对照组灌胃给予阿法骨化醇1ml/100g体重，给药浓度为0.005μg，/ml，给药剂量为0.05μg/kg体重；滋补肾阴组灌胃给予左归丸水煎剂1ml/100g体重，给药浓度为0.952g生药/ml，给药剂量为9.52g生药/kg体重，以上给药每天1次，每周6天，连续8w。各组大鼠于处死前16天和前3天分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重，以对骨进行荧光标记。给药结束后，采用大鼠麻醉后股动脉取血法，所取全血静置1h后，经2000rmp离心10 min后取血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清中BGP、E2、PTH、IGF—Ⅰ的水平。取血后将各组大鼠处死，取右侧胫骨近端1/3，制作不脱钙骨切片，采用骨组织形态计量学方法，检测各组大鼠胫骨骨小梁体积百分比(TBV％)、骨小梁吸收表面百分比(TRS％)、骨小梁形成表面百分比(TFS％)、骨小梁矿化率(MAR)、类皮质平均宽度(OSW)、骨皮质矿化率(mAR)，以观察各组大鼠骨形成及骨吸收等骨代谢情况。取左侧胫骨近端1/3，制作大鼠胫骨脱钙骨的冰冻切片，分别采用免疫组化、原位杂交法检测各组大鼠胫骨成骨细胞及骨髓基质细胞中Wntl、LRP—5及β—catenin蛋白及mRNA的表达。 2.体外实验： 2.1左归丸含药血清的制备雌性Wistar大鼠20只，随机分为2组：正常对照组和左归丸治疗组，每组10只。左归丸治疗组大鼠：地塞米松0.1mg/100g肌注，每周2次，连续8w，然后灌服左归丸，一日2次，连续5次，于末次给药1h，乙醚麻醉，无菌条件下，经腹主动脉采血，冷置1h后，离心(2500r/min，25min)，分离血清，是为左归丸含药血清，56℃灭活30min，—20℃冰箱保存备用。正常对照组按以上程序，灌服等容积的蒸馏水，所取血清即正常对照组血清。 2.2 MTT法测定不同实验条件对成骨细胞增殖的影响本实验分为6组：成骨细胞(OB)+正常血清组，OB+10—7 mol/L地塞米松组，OB+10—8 mol/L地塞米松组，OB+5％左归丸含药血清组、OB+10％左归丸含药血清组、OB+15％左归丸含药血清组，每组8个样本。将成骨细胞悬液浓度调节至为1×104/ml，将其接种至96孔细胞培养板，每孔200μl，培养12h细胞贴壁后，分别用正常对照组血清10—7 mol/L地塞米松、10—8 mol/L地塞米松、5％左归丸含药血清、10％左归丸含药血清、15％左归丸含药血清处理各组细胞，5％CO2，37℃继续培养96h，然后用MTT法于酶标仪上检测波长为570nm处各种细胞的OD值。 2.3左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA表达的影响本实验分为3组：正常血清组，地塞米松组，左归丸含药血清组。培养12h后，分别用正常对照组血清、10—7 mol/L地塞米松、15％左归丸含药血清处理各组细胞，继续培养96h。随后分别采用免疫印迹法及荧光实时定量PCR(Realtime PCR.)技术检测各组细胞中Wnt3α、LRP—6、β—catenin蛋白及mRNA的表达。 3统计学分析以上实验结果皆以均数±标准差((x)±s)表示，采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据处理，组间两两比较，采用q检验。结论：滋补肾阴法对糖皮质激素所致大鼠的骨质疏松症具有明显的治疗作用，其作用途径有三：第一，促进成骨细胞的增殖，进而使骨形成增加。第二，使Wnt信号传导通路的关键信号分子——Wnt、LRP及β—catenin的表达上调。具体途径是，增强Wnt信号，使其与受体LRP的结合增多，则β—catenin蛋白不会被降解而在胞内聚集，从而可以进入细胞核内，与转录因子TCF结合激活基因转录过程。这一方面促进了成骨细胞的定向、分化、发育、增殖，并抑制其凋亡；另一方面也通过成骨细胞的介导作用抑制了破骨细胞的活性，最终使骨形成增加而骨吸收降低，骨量丢失的状态得到控制和恢复。第三，调节血清中PTH、BGP、E2、IGF—Ⅰ的水平：提高外周血中E2、IGF—Ⅰ、BGP的水平而降低PTH的水平，使糖皮质激素所致的这些因子的紊乱状态得以基本恢复正常，从而防止骨量的丢失。

作者：

刘梅洁

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关键词：

滋补肾阴法骨质疏松成骨细胞 Wnt LRP β—catenin

授予学位：

博士

学科专业：

中西医结合基础

导师：

鞠大宏

学位年度：

2009

学位授予单位：

中国中医科学院

语种：

中文

中图分类号：