摘要
第一部分 B细胞活化因子及其受体在系统性红斑狼疮患者中的表达 背景和目的： 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是经典的、慢性、多系统受累的自身免疫病，B细胞的异常活化及分化是SLE的特征之一。B细胞通过产生自身抗体介导组织损伤，递呈抗原给自身反应性T细胞，以及产生可溶性介质触发和维持炎症反应等参与SLE发病机制的多个环节。B细胞的发育、分化和功能受到B细胞活化因子（B cell activating factorbelonging to TNF family，BAFF）这一TNF超家族成员的调节。BAFF通过与其受体结合，提供B细胞生存信号、促进Ig类别转换，并促使B细胞向ISC（immunoglobulinsecreting cells）分化。BAFF过表达可使自身反应性B细胞有可能克服自身抗原触发的强死亡信号，促使异常的ICS长期存活免于凋亡，从而参与SLE的发病和维持。APRIL作为BAFF的同源分子与其共享某些生物功能。 已有多篇报道对自身免疫病中BAFF的表达情况进行了探索，但这一领域内研究结果存在较多分歧。造成分歧的一个可能原因是分析时未对患者在入组前是否已接受治疗加以考虑。 在本研究中，我们试图分析BAFF、APRIL及其受体BR3（BAFF receptor，BAFF-R，BR3）、BCMA（B cell maturation antigen）和TACI（transmembrane activaterof and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor）在SLE患者不同组群中的表达差异及其与临床特征的相关性，探索BAFF及其受体在SLE临床谱中的表达规律，深化我们对BAFF在SLE发病机制中作用和地位的认识，并为BAFF拮抗剂的靶向性治疗提供更多依据。 研究方法： 明确诊断为SLE的患者73人，同期选取年龄性别匹配的健康对照28人，采集抗凝外周静脉血分离单个核细胞。 流式细胞术检测外周血PBMC中BR3、TACI和BCMA在B细胞及其各亚群中的表达。 EIJSA法检测血浆BAFF和APRIL的水平。 荧光定量PCR法检测BR3、TACI和BCMA的mRNA水平。 外源性BAFF共培养测定BAFF对BR3、TACI和BCMA.表达的影响。 收集患者临床资料，按照SLEDAI2000评分体系评价患者疾病活动度，按照初治vs.经治、活动vs.稳定、治疗前vs.治疗后以及脏器受累情况分组评价。 结论： SLE患者血浆BAFF水平明显增高和B细胞上BR3表达下调，可作为病情活动的标志物。BR3是外周血B细胞上表达的最主要的BAFF受体。PBMC中BR3mRNA的水平SLE患者与健康对照并无差异，高表达BR3的健康对照PBMC在与BAFF孵育后出现。BR3下调，推测SLE患者外周血B细胞上BR3的实际表达水平与健康对照可能并无差异，而由于高水平BAFF占据其结合位点导致可检测到的BR3蛋白水平下调，提示BAFF/BR3通路在SLE患者中存在过度激活，这种BAFF/BR3通路的过度激活在活动性狼疮患者和肾脏受累的狼疮患者中更为显著。而TACI的表达上调与狼疮肾炎密切相关。初治活动特别是有肾脏受累的狼疮患者有可能从BAFF拮抗剂的靶向治疗中获益最大。 第二部分T辅助细胞亚群的比例失调与系统性红斑狼疮临床表现的关联 背景和目的: T辅助细胞功能异常在SLE多重免疫紊乱中占有重要地位，近年来对T辅助细胞亚群成员的认识拓展至Th1、Th2、Treg和Th17，几个亚群的Th细胞在发育和功能上既相互联系，又相互牵制，其分泌的细胞因子构成调控免疫的细胞网络和细胞因子网络：Th1分泌：IFNγ、IL-2、TNF-α、IL-12等细胞因子，参与巨噬细胞活化，刺激细胞毒T细胞的增殖和分化，参与细胞免疫；Th2能分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子，促进B细胞的增殖、分化和抗体生成，参与体液免疫；Treg细胞能分泌TGF-β和IL-10，具有增殖无能的特点并能够通过细胞间接触抑制效应T细胞增殖而具有免疫调节作用。Th17则能分泌IL-17、IL-22等，参与抗感染免疫，促进炎症，参与组织损伤和炎症性骨破坏，Th17在类风湿关节炎、炎症性肠病和多发性硬化等疾病中的作用逐渐为人们所认识。SLE中Treg和Th17的研究也是近年来研究的热点，本研究通过胞内核转录因子Foxp3和胞内细胞因子（IFNγ、IL-4、IL-17）染色进行流式细胞仪检测初步分析T辅助细胞比例失衡与SLE临床疾病谱的相关性。 研究方法: 明确诊断为SLE的患者46人，同期选取年龄性别匹配的健康对照29人，采集抗凝外周静脉血分离单个核细胞PBMC。 PBMC进行CD4和CD25表面染色和胞内Foxp3染色，流式细胞仪检测。 PBMC在RPMI1640完全培养基中与PMA、Ionomycin共培养，刺激胞内细胞因子分泌，并加入Golgiplug阻断细胞因子释放，进行胞内细胞因子IFNγ、IL-4、IL-17染色及膜表面CD4染色，流式细胞仪检测。 收集患者临床资料，按照SLEDAI2000评分体系评价患者疾病活动度，并按疾病活动性及脏器受累情况分组评价。 结论: SLE患者存在T辅助亚群比例失调，Th2细胞比例增高，可能是B细胞过度活化和自身抗体的持续产生的机制之一。活动性SLE患者伴有Th1和Th17细胞比例增高，T辅助细胞中Th17的比例与病情活动度和肾脏受累相关，提示Th17在SLE发病机制和脏器受累中发挥重要作用。尽管合并脑病的SLE患者出现调节性T细胞比例增高，但SLE患者整体的Treg水平与健康对照无显著差异，合并脑病的患者中的增高可能是一种保护机制。SLE患者中CD4+CD25-Foxp3+T细胞增多，该群细胞性质未明，可能是效应性T细胞。 第三部分SLE患者CD200/CD200R1通路异常的意义初探 背景和目的: CD200是表达于多种免疫和炎症相关细胞类型上的Ⅰ型膜糖蛋白。CD200可表达于树突细胞、内皮细胞、活化T细胞等，与其受体CD200R结合可传递免疫调节信号，在实验动物中可参与调节免疫应答阈值和细胞因子产生极向，参与维持免疫稳态，防止移植排斥和自身免疫疾病。目前对CD200/CD200R轴的研究多局限于动物，主要集中在CIA、EAE等自身免疫病模型以及对肥大细胞和巨噬细胞功能影响方面研究。对其人体内的生物学功能的认知还十分有限，在SLE中的作用罕有报道。在本实验室的前期工作中发现CD200 mRNA和CD200R mRNA在SLE患者表达降低，表达CD200的PBMC比例增高，为探讨CD200蛋白在SLE中增高的意义进行本研究。本研究就CD200信号是否对T辅助亚群的比例平衡产生调节和影响以及CD200信号通路对PBMC增殖的影响进行了探讨。 方法: SLE患者和健康对照PBMC与CD200Fc、CD200R1 Fc和anti.CD200R1共培养48小时，胞内细胞染色流式细胞术测定T辅助亚群中Th1、Th2、Th17和Treg的比例变化；ELISA法测定培养上清中IL-17的水平。 PBMC经CFSE标染后分别给予CD200 Fc、CD200R1 Fc或anti-CD200R1共培养96小时，或给予PHA、抗CD3/CD28刺激增殖，同时加入CD200 Fc、CD200R1Fc或anti-CD200R1共培养96小时激活或阻断CD200信号通路，流式细胞术检测增殖情况。 结论: SLE患者血清中游离的CD200增高，经过激素和免疫抑制药物治疗后下降至正常。CD200 Fc、CD200R Fc和antiCD200R1对健康对照外周血T辅助细胞亚群的比例调节作用较小，而在SLE患者中，CD200通路活化可使Th17细胞比例减低，阻断CD200信号通路则可使Th1细胞比例增高，CD200信号通路参与SLE患者T辅助细胞亚群的比例调节。体外增殖实验中，anti-CD200R1阻断CD200R信号可对抗CD3/CD28刺激的PBMC增殖起到促进作用。CD200信号通路在SLE患者中的增高具有一定保护意义。
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