摘要
食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其浸润转移是患者预后差、死亡率高的关键因为。恶性肿瘤的浸润转移过程是一个多基因多信号通路参与调节的复杂的分子过程,上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是肿瘤发生浸润转移的重要的和必要的起始步骤。在EMT过程中,上皮细胞失去极性,细胞丢失E-cadherin、ZO-1(紧密连接蛋白)等上皮性标志,获得vimentin(波形蛋白)、fibronectin(纤维连接蛋白)等间质性标志,同时细胞的侵袭能力和运动能力增强。 Akt,也被称为蛋白激酶B,是一种进化上十分保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,在PI3K/Akt信号传导通路中起关键作用。哺乳动物细胞中的Akt有三种亚型,Akt1、Akt2和Akt3。在生长因子等细胞外生长信号的刺激下,细胞表面的受体酪氨酸激酶激活并活化PI3K产生PIP3(磷脂酰-3-磷酸肌醇),进而使Akt发生磷酸化活化,调节细胞的增殖、分化及蛋白合成,并参与血管形成,肿瘤的浸润和转移等过程。除了影响细胞的增殖和凋亡,Akt还能够通过磷酸化糖原合成酶-3(GSK-3β)来上调Snail(E-cadherin的转录抑制子)的表达,促使EMT的发生。在胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中都存在着Akt的异常高表达,但有关食管鳞癌组织中Akt的表达与食管鳞癌EMT的关系,国内外的报道较少。 转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种多效能的细胞因子,参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等一系列细胞进程。除此以外,TGF-β可以诱导多种细胞发生EMT,是目前已知的EMT的主要诱导子,它不仅能够诱导生长发育和创伤愈合中生理性EMT的发生,还能够诱导纤维化和肿瘤进程中.病理性EMT的发生。 为探讨食管鳞癌中PI3K/Akt信号通路与EMT的关系,本研究采用免疫组织化学法检测了食管鳞癌组织及正常食管粘膜中Akt、p-Akt和E-cadherin蛋白的表达情况；以食管鳞癌细胞EC9706为研究对象,采用RNA干扰技术特异性地阻抑Akt的表达,并以外源性的TGF-β1刺激,探讨RNA干扰、TGF-β1刺激以及刺激与干扰联合作用对Akt表达的影响,观察食管鳞癌细胞EC9706中E-cadherin和vimentin表达的改变,以及对细胞侵袭能力的影响,并观察细胞形态的变化。 材料和方法： 1.采用免疫组织化学SP法检测80例食管鳞癌组织及80例正常食管粘膜组织中Akt、p-Akt和E-cadherin蛋白的表达: 2.Akt siRNA转染食管鳞癌细胞EC9706 2.1倒置显微镜下观察Akt基因沉默后细胞的形态学变化； 2.2 RT-PCR、Western-blot法分别检测转染Oh(转染前)、24h、48h、72h后细胞中Akt、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达； 2.3 MTT法检测细胞增殖能力的变化; 2.4 Boyden chamber侵袭小室实验检测细胞侵袭力的变化。 3.以外源性TGF-β1作用于食管鳞癌细胞EC9706 3.1倒置显微镜下观察TGF-β1或TGF-β1与Akt siRNA联合作用下细胞的形态学变化； 3.2 RT-PCR、Western-blot法分别检测在TGF-β1及TGF-β1与Akt siRNA联合作用下Akt、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达； 3.3 Boyden chamber侵袭小室实验检测在TGF-β1及TGF-β1与Akt siRNA联合作用下细胞侵袭力的改变； 4.统计学处理:采用统计软件SPSS10.0进行统计学处理。计数资料计算阳性率,阳性率之间的比较采用x2检验(Chi-square),相关性分析采用Spearman相关分析法进行分析；计量资料用(X)±S表示,两组均数的比较用t检验(t-test),两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA)。以α=0.05为检验标准。 结果： 1.免疫组化结果: 1.1食管鳞癌组织中Akt蛋白的阳性表达率为72.5％,明显高于正常食管粘膜(32.5％)(P<0.01)；p-Akt蛋白的阳性表达率为81.3％,显著高于正常食管粘膜组织(15.0％)(P<0.01)；E-cadherin蛋白的阳性表达率为33.8％,明显低于正常食管粘膜(86.3％)(P<0.01)； 1.2 Akt蛋白的表达随食管鳞癌组织分化程度的降低而不断增加(P<0.05),其中高分化者为47.4％,中分化者为70.0％,低分化者为100％;浸润浅层者Akt蛋白的阳性表达率为43.8％,较浸润深层者(79.7％)差异显著(P<0.05),同时有淋巴结转移组与无淋巴结转移组之间的差别也有统计学意义(90.0％vs66.7％,P<0.05);p-Akt蛋白在高分化食管鳞癌组织中的表达为68.4％,在中分化者中为80.0％,低分化者中为95.2％,差异有统计学意义(P<0.05)；在高分化食管鳞癌组织中E-cadherin蛋白的阳性表达率为57.9％,中分化者中为35.0％,低分化者中为9.5％,差异显著(P<0.05)；随食管鳞癌组织浸润深度的增加,E-cadherin蛋白的表达不断降低(P<0.05),浸润浅层者为56.3％,浸润深层者为28.1％; 1.3在食管鳞癌组织中,Akt蛋白与p-Akt蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈正相关关系(P<0.05),E-cadherin蛋白的阳性表达与Akt和p-Akt的表达均呈负相关关系(P<0.05)。 2.Akt siRNA干扰实验结果: 2.1形态学改变:转染Akt siRNA后部分细胞皱缩,细胞形态不规则,细胞内颗粒增多,折光性降低,细胞碎片增多； 2.2 RT-PCR结果:除0h组以外,干扰后24h、48h、72h干扰组Akt mRNA的表达量(0.794±0.043、0.601±0.059、0.414±0.040)与同时间点空白对照组(0.862±0.022、O.859±0.089、0.867±0.100)、空脂质体组(0.914±0.051、0.899±0.036、0.945±0.071)及阴性对照组(0.885±0.070、0.871±0.055、0.895±0.033)相比,差异有统计学意义(P均<0.05),且随着干扰时间的延长,AktmRNA的表达逐渐降低(P均<0.05)；除0h组以外,干扰组E-cadherin mRNA的表达量24h(1.150±0.102)、48h(1.388±0.073)及72h(1.623±0.138)与同时间点空白对照组(0.775±0.043、0.724±0.084、0.769±0.056)、空脂质体组(0.732±0.078、0.769±0.047、0.743±0.082)及阴性对照组(0.768±0.026、0.729±0.085、0.718±0.064)相比,差异有统计学意义(P均<0.05),随着干扰时间的延长,E-cadherin mRNA的表达逐渐升高(P均<0.05)；干扰组vimentin mRNA的表达量在48h(1.234±0.048)及72h(1.052±0.033)均高于同时间点空白对照组(1.390±0.009、1.387±0.017)、空脂质体组(1.391±0.032、1.382±0.023)及阴性对照组(1.389±0.034、1.399±0.036),差异有统计学意义(P均<0.05),在干扰组中,48h较Oh(1.409±0.032)及24h(1.397±0.037)均有显著差异,72h较48h有显著差异(P均<0.05)； 2.3 Western-blot结果:干扰后Akt蛋白的表达从48h开始(48h:0.555±0.045、72h:0.356±0.043),与同时间点空白对照组(0.705±0.022、0.692±0.054)、空脂质体组(O.704±0.036、0.711±0.028)及阴性对照组(0.694±0.111、0.689±0.077)相比显著下降(P<0.05),在干扰组中72h与48h之间具有显著差异(P<0.05)；转染后,E-cadherin蛋白的表达量逐渐升高,48h与24h相比(0.455±0.057 vs0.309±0.072)差异有显著性(P<0.05),72h与48h之间也具有显著性差异(0.620±0.041 vs0.455±0.057,P<0.05),且48h与72h时与同时间点空白对照组(0.307±0.023、0.316±0.065)、空脂质体组(0.299±0.017、0.302±0.040)及阴性对照组(0.305±0.032、0.314±0.024)相比差异明显(P<0.05);随着干扰时间的延长,vimentin蛋白的表达量逐渐降低(0.563±0.034、0.447±0.034、0.356±0.043),差异具有统计学意义(P均<0.05),同时间点干扰组与空白对照组(0.696±0.030、0.704±0.039、0.681±0.046)、空脂质体组(0.709±0.041、O.718±0.050、0.715±0.021)及阴性对照组(0.700±0.039、0.712±0.022、0.698±0.041)相比vimentin蛋白的表达有显著区别(P均<0.05)；2.4 MTT实验结果:转染后干扰组细胞的增殖水平较同时间点各对照组(空白对照组、空脂质体组及阴性对照组)降低,其中48h、72h时,干扰组(0.746±0.025、0.823±0.011)与同时间点空白对照组(0.860±0.032、1.026±0.076)、空脂质体组(0.834+0.025、1.042±0.106)及阴性对照组(0.838±0.033、1.003±0.010)之间有显著性差异(P均<0.05)； 2.5体外侵袭实验结果:干扰后细胞的体外侵袭能力逐渐下降(89.80±6.98、68.80±10.43、47.60±8.32),48h与24h相比差异有显著性,72h与48h相比差异有显著性(P均<0.05),同时,在48h和72h时,干扰组与空白对照组(97.40±4.72、88.00±7.65)、空脂质体组(93.00±10.49、92.4±13.18)及阴性对照组(85.80±5.40、90.60±5.13)之间穿膜细胞数有显著性差异(P均<0.05)。 3.TGF-β1刺激食管鳞癌细胞EC9706; 3.1形态学改变:TGF-β1作用后部分细胞体积增大,细胞伸长,由多边形向长梭形转变,并且细胞排列松散,细胞间隙增宽；TGF-β1与Akt siRNA联合作用下部分细胞皱缩,细胞内颗粒增多,折光性降低,细胞碎片增多； 3.2 RT-PCR结果:在TGF-β1的作用下,Akt mRNA及vimentin mRNA的表达量较空白对照组明显升高(1.007±0.173 vs0.801±0.032,0.687±0.134 vs0.542±0.073),E-cadherin mRNA的表达量较空白对照组明显下降(0.452±0.122 vs0.661±0.060)(P均<0.05)；在TGF-β1与Akt siRNA联合作用下,Akt mRNA及vimentin mRNA的表达较TGF-β1单独作用组明显下调(0.681±0.073 vs0.854±0.071,0.475±0.083 vs0.706±0.078),E-cadherin mRNA的表达较TGF-β1单独作用组明显上调(0.607±0.053 vs0.501±0.070)(P均<0.05)； 3.3 Western-blot结果:TGF-β1刺激组各指标的蛋白表达量与空白对照组相比均有显著差异(P均<0.05),其中,Akt蛋白和vimentin蛋白的表达量显著上调(0.747±0.078 vs0.631±0.065,0.677±0.070 vs0.577±0.049),E-cadherin蛋白的表达量显著下调(0.282±0.032 vs0.428±0.032);TGF-β1与Akt siRNA联合作用组Akt蛋白与vimentin蛋白的表达与TGF-β1单独作用相比明显下调(0.436±0.067 vs0.615±0.076,0.553±0.036 vs0.730±0.114),E-cadherin蛋白的表达量明显上调(0.414±0.059 vs0.229±0.063),差异均具有统计学意义(P均<0.05)； 3.4体外侵袭实验结果:TGF-β1刺激组的穿膜细胞数显著高于空白对照组(99.80±11.99 vs79.00±9.49),差异具有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1与AktsiRNA联合作用组穿膜细胞数明显降低,与TGF-β1单独作用组相比差异显著(85.80±14.29 vs117.20±6.22,P<0.05)。 结论： 1.食管鳞癌组织中E-cadherin的低表达可能与Akt信号通路的高活性状态有关,提示Akt可能通过调控E-cadherin的表达参与食管鳞癌的EMT。 2.Akt siRNA能够特异性地抑制食管鳞癌细胞中Akt的表达,并阻断食管鳞癌细胞的EMT过程,导致食管鳞癌细胞的侵袭能力降低,并对细胞的增殖也具有抑制作用,提示Akt有望成为抑制食管鳞癌恶性进展的有效靶点。 3.外源性TGF-β1能够诱导食管鳞癌细胞发生EMT样改变,增强细胞的体外侵袭能力；Akt siRNA能够阻断由TGF-β1引起的EMT。
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