摘要
背景和目的 胰腺癌是恶性程度很高的肿瘤,临床治疗效果不佳且预后极差,因此阐明胰腺癌的发病机制并寻找新的治疗靶点成为我们亟需解决的问题。研究发现,人类染色体20q13位点存在很多肿瘤相关基因的扩增,而人类真核延伸因子1A2(EEF1A2)则位于20q13.3,传统观点认为,EEF1A2作为一个管家基因,主要参与蛋白的翻译过程。但是,新近的研究表明EEF1A2可能与肿瘤的发生发展有着密切的关系。因此,本研究拟探讨EEF1A2在人类胰腺癌中的表达情况,并通过体内及体外实验观察静默EEF1A2是否影响胰腺癌的发生发展及其可能的作用机制。 方法： 1.收集临床手术标本56例,包括正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织及胰腺癌组织,培养人胰腺癌细胞株SW1990、BxPC-3、Patu8988,通过PCR及免疫蛋白印迹法检测EEF1A2 mRNA和蛋白在胰腺癌细胞及组织中的表达情况。同时,应用免疫组化检测eEF1A2蛋白在胰腺组织中的表达定位情况及细胞内分布。 2.根据EEF1A2基因序列,设计并合成特异性针对EEF1A2的小分子干扰引物,转染EEF1A2高表达的人胰腺癌细胞株BxPC-3,筛选干扰效率最高的siRNA及最佳转染条件。 3.将EEF1A2 siRNA转染至BxPC-3细胞,应用MTT和流式细胞术检测细胞的增殖和周期分布,采用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡,运用划痕实验检测细胞迁移能力。 4.将EEF1A2 siRNA转染至BxPC-3细胞,运用免疫蛋白印迹法检测细胞增殖通路及细胞凋亡通路中相关蛋白表达的变化。 5.建立人胰腺癌裸鼠移植瘤模型,瘤内分别注射EEF1A2 siRNA、scramble siRNA及PBS,检测各组移植瘤的体积及重量,绘制移植瘤生长曲线,应用免疫组化方法检测移植瘤组织中EEF1A2、PCNA及TUNEL的表达情况。 结果： 1.EEF1A2在人胰腺癌细胞株BxPC-3及Patu8988中呈强表达,而在SW1990细胞中的表达很低；在正常胰腺组织及慢性胰腺炎组织中,几乎检测不到EEF1A2的表达,而在83％的胰腺癌组织中EEF1A2的表达异常增高。此外,eEF1A2蛋白主要位于胰腺癌导管上皮细胞的胞浆内,在腺泡细胞及胰岛细胞中均未见显著表达。 2.设计合成的两对siRNA均能有效降低BxPC-3细胞中EEF1A2的表达,其中当LipofectamineTM2000浓度为2μl,siRNA浓度为10nM时,第一对siRNA达到了最佳静默效果,EEF1A2在mRNA和蛋白水平的表达抑制率达到80％左右。 3.MTT结果显示,EEF1A2的表达降低可以显著抑制细胞的增殖；FACS分析细胞周期提示,EEF1A2组G2/M期细胞比例显著高于空白组和阴性对照组；流式细胞仪检测凋亡结果表明,EEF1A2组细胞的早期凋亡率为18.92±4.06％,显著高于与阴性对照组(7.84±2.12％)和空白组(6.97±1.97％),TUNEL法也得到了相同的结果；但是体外划痕实验显示,抑制EEF1A2表达对胰腺癌细胞BxPC-3的运动能力并无明显作用。 4.免疫蛋白印迹的结果显示,抑制EEF1A2基因的表达可以引起下游信号转导通路蛋白表达的变化,这些差异表达的蛋白涉及细胞增殖和凋亡,如Caspase-3,8,9,PARP,细胞色素c和p-Akt等。 5.体内实验证实,EEF1A2组移植瘤的生长速度低于阴性对照组和空白组,移植瘤的质量也显著小于其他两组；同时免疫组化的结果显示EEF1A2组细胞中PCNA的表达明显低于阴性对照组和空白组,而凋亡细胞数则明显高于其他两组。 结论： 1.相对于正常胰腺组织及慢性胰腺炎组织,EEF1A2在胰腺癌组织及部分人胰腺癌细胞株中表达异常增高。 2.RNA干扰介导的EEF1A2基因表达的下降,可以抑制人胰腺癌细胞BxPC-3的生长增殖,促进细胞凋亡,但对细胞的迁移能力无明显影响。其机制可能通过调节下游增殖及凋亡信号通路中肿瘤相关蛋白的表达。 3.RaNA干扰介导的EEF1A2基因表达的下降,可以明显减慢人胰腺癌裸鼠移植瘤的生长,可能与抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡有关。
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