摘要
目的：1.对快速荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT）检测体系进行本土化改进，以适应国内实验室条件和检测需求；2.对改进后的RFFIT 体系进行效果评估；3. 将本室已经应用成熟的RFFIT 体系与狂犬病疫苗抗原检测方法进行融合，形成改良抗体结合试验（modified antibody binding test, M-ABT）。 方法：1. 将BSR（BHK-21小克隆）、BHK-21（金黄地鼠肾细胞）、MNA（小鼠成神经纤维瘤细胞）三种细胞以及CVS-11、CTN-181两株狂犬病病毒分别引入RFFIT 检测体系，以不同组合方式检测10份标本，初步鉴定检测结果的一致性；继而检测106 份人血清样品，系统比较不同组合方式下RFFIT 检测结果的差异。2.对1011份人血清样品进行RFFIT 检测，评估经过本土化改进的RFFIT 检测体系的检测效能。3. 利用自行制备的Alexa 488 标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体对200份标本进行RFFIT 检测，评估自主制备的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体进行RFFIT 检测的效果。4. 将RFFIT与抗体结合试验（antibody binding test, ABT）方案融合，在疫苗样品稀释、剩余中和抗体检测、结果计算方面进行改进，形成改良抗体结合试验（M-ABT）。应用M-ABT对10种灭活狂犬病疫苗在不同库存时间的疫苗效力进行检测，观察疫苗效力随时间改变的情况。 结果：1.细胞培养：BSR、BHK-21、MNA细胞生长状况良好，建立了这3种细胞的细胞种子库；2. 病毒培养：狂犬病病毒CVS-11和CTN-181株对BSR、BHK-21、MNA细胞适应良好，各代次病毒滴度均高于106 FFU/ml，符合RFFIT 检测体系对毒种的要求；3. 改变细胞系和毒种后RFFIT 检测体系的检测效能评估：10份小批量样本检测：分别引进BHK-21和MNA细胞系以及CTN-181病毒株后，RFFIT 检测结果与采用BSR和CVS-11组合进行检测所得结果间差别无统计学意义，P值均大于0.05；106 份大批量样本的检测结果也表明引入新的细胞系和毒株后RFFIT检测体系与国际标准体系检测结果间差别无统计学意义，并且有很好的相关关系，相关系数（r）大于0.75。4. 改进RFFIT 检测体系应用效果评估：⑴不同细胞系对RFFIT 检测结果的影响：以CVS-11病毒株作为攻击病毒，分别应用BSR、BHK-21、MNA细胞系，对1011份人血清样品进行RFFIT 检测，不同检测体系的阳性检出率差别无统计学意义，P值均大于0.05；不同检测体系下阳性标本检测结果几何均值（geometric mean titer, GMT）差别无统计学意义，P值均大于0.05；不同检测体系下检测结果相关性较好，相关系数r大于0.75；⑵不同操作环境对RFFIT 检测结果的影响：在不同地理位置、操作环境迥异的实验室，由相同的操作人员应用CVS-11毒株和BHK-21细胞系对上述阳性人血清标本再次进行RFFIT 检测，检测结果与原实验室环境下进行检测所得结果间差别无统计学意义，P值均大于0.05。5. 采用自主制备Alexa 488 标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体后RFFIT 检测体系检测效能评估：对200份血清样品的检测显示采用自主制备Alexa 488 标记抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体与进口单抗Millipore DFA 5100检测结果差别无统计学意义，相关系数r=0.980。6. M-ABT 法的建立和初步应用效果分析：10种待测狂犬病疫苗经M-ABT 法检测，结果显示疫苗中抗原含量与NIH 法测定结果差别没有统计学意义，并且具有很好的相关关系，相关系数r=0.927，提示M-ABT 法可用于监测狂犬病疫苗抗原的效价变化情况。 结论：1. 实现了应用不同细胞系和狂犬病病毒株进行RFFIT 检测：将致病性更弱的CTN-181毒株应用于狂犬病病毒中和抗体的实验室检测，增加了检测安全性；使用常见的BHK-21、MNA细胞系使更多实验室建立和应用该检测技术成为可能；2.不同操作环境对RFFIT 检测结果的影响不明显，因此，同一批操作人员使用相同的检测体系在不同实验室进行RFFIT 检测的结果均衡可比并可信；3. 自主制备的Alexa488 标记抗狂犬病核蛋白单克隆抗体可以用于国内RFFIT 检测；4. M-ABT 法已经建立，用于灭活狂犬病疫苗效力检测时与NIH 法检测结果高度一致，是一种合适的灭活狂犬病疫苗效力监测技术手段。
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