摘要
背景与目的： 肾小管间质损害是各种终末期肾病的共同通路，其病变程度与慢性肾病患者预后密切相关。肾小管间质的损害是以间质炎细胞浸润为主要特征，其中尤其以T细胞、巨噬细胞的浸润和活化最为关键。这些浸润的炎性细胞通过分泌炎症因子可激活局部炎症反应，进而引起小管间质损害和纤维化。有效减轻肾小管间质炎症及纤维化反应，对减缓肾脏病变向终末期肾脏疾病发展具有尤为重要的意义。 共刺激分子是一类细胞膜表面分子，可分别为T、B细胞的活化提供必要的辅助信号，从而调节细胞的增殖、活化及分化。近年来在肾脏疾病的实验研究中，通过对CD28、CD40和ICOS等共刺激途径的抑制来间接诱导效应T细胞的无能，以达到减少肾组织损伤的目的，已经取得了一定的效果。VSIG4(V-set and immunoglobulindomain-containing protein 4)又称补体受体Ig 超家族分子(Complement receptor of theimmunoglobulin superfamily，CRIg)，或Ig 超家族蛋白-39(Ig superfamily protein 39,Z39Ig)，为I 型跨膜分子，是新近鉴定的对T细胞的活化和存活具有重要调节作用的B7家族共刺激分子。VSIG4 主要表达在单核来源的巨噬细胞上，在成人体内单核巨噬细胞主要分布的组织如肝、肺等均有VSIG4mRNA的表达。近期研究显示，VSIG4 可交联其尚未知的受体分子抑制T细胞活化，发挥共抑制分子配体的功能。前期在对肾病患者肾活检标本的研究中发现所有标本均有不同程度的T细胞浸润，而T细胞周围有丰富的巨噬细胞；该群巨噬细胞特异表达VSIG4，且VSIG4 主要表达在小管间质损伤轻的区域。我们推测巨噬细胞表达的VSIG4 发挥共刺激分子配体的作用，通过与T细胞表面尚未知的受体作用，抑制T细胞的活化，降低T细胞炎症因子分泌，减低T细胞对邻近细胞的活化，从而改善肾间质炎症及纤维化的病理进程。 本试验拟采用VSIG4基因敲除(VSIG4-/-）小鼠及VSIG+/+小鼠建立单侧输尿管梗阻(UnilaterAlureterAlocclusion，UUO)模型，通过比较两组肾小管间质损伤程度及体内T细胞、巨噬细胞功能的差异，探讨VSIG4对肾小管间质损伤的治疗作用及其机制。为肾间质炎症及纤维化的防治寻找新的思路。方法： SPF级雄性C57B6(VSIG4-/-及VSIG4+/+）小鼠共40只，其中VSIG4-/-组、VSIG4+/+组小鼠各20只，两组小鼠分别行左侧输尿管结扎，建立单侧输尿管梗阻(UnilateralureterAlocclusion，UUO)模型，并分别于假手术对照组、术后3、7、14天取小鼠左肾(每个时相点各5只小鼠，对照组剖腹不结扎)，HE 染色观察左侧肾脏肾小管损伤及间质炎性细胞浸润程度，生化指标检测小鼠血肌酐、尿素氮，免疫组化观察肾组织转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)、基质金属蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase 2，MMP-2)、CD3+T细胞及CD68+巨噬细胞，免疫荧光观察CD3+、CD4+及CD8+T细胞变化情况，Real-time PCR 观察白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)、肿瘤坏死因子-α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α）、γ-干扰素(Interleukin-γ，IFN-γ）、白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)的表达，比较两组之间的差别，并进行统计学分析。 结果显示： ①IL-2 mRNA在VSIG4+/+组术后表达量增加(p＜0.05)，术后14天表达量达高峰； 在VSIG4-/-组术后表达量也增加(p<0.05)，术后14天达高峰。VSIG4-/-组IL-2在术后3天、14天表达较VSIG4+/+组相同时相点表达增多。 IFN ②-γ mRNA在VSIG4-/-及VSIG4+/+组术后肾组织中均有表达，术后7天、14天VSIG4+/+组IFN-γ表达量较术后3天明显增加(p<0.01)；术后7天、14天VSIG4-/-组IFN-γ表达也较术后3天增加(p<0.05)。VSIG4-/-组术后IFN-γ表达较VSIG4+/+组相同时相点表达明显增多(p<0.01)。 IL ③-10mRNA在VSIG4+/+组肾组织随梗阻时间延长表达量逐渐增加(p<0.05)，同样在VSIG4-/-组术后IL-10随梗阻时间延长表达量也逐渐增加(p<0.01)。但IL-10mRNA在VSIG4-/-组术后14天表达较VSIG4+/+组相同时相点表达明显减少。 TNF ④-αmRNA在VSIG4+/+组术后3天肾组织中的表达与对照组无明显差别(p＞ 0.05)，术后7天表达开始增加；在VSIG4-/-组TNF-α的表达随梗阻时间延长而逐渐增加(p＜0.05)。VSIG4-/-组TNF-α术后7天、14天表达较VSIG4+/+组同期表达增多(p<0.05)。 5、免疫荧光检测结果显示：VSIG4+/+组肾组织中术后CD3+、CD4+、CD8+T细胞均随梗阻时间延长表达逐渐增加；在VSIG4-/-组表达趋势同VSIG4+/+组术后；然而，在VSIG4-/-组术后表达较同期VSIG4+/+组表达上调。免疫组化检测结果显示：VSIG4+/+组术后CD68+巨噬细胞随梗阻时间延长表达增加，术后7天达高峰，在VSIG4-/-组中表达趋势相同，但VSIG4-/-组术后表达与同期VSIG4+/+组表达无显著差异。 结论： 1.本实验成功制备VSIG4+/+及VSIG4-/-单侧输尿管梗阻小鼠动物模型。 2.vsIG4-/-组小鼠术后肾间质炎细胞浸润及小管损伤重于VSIG4+/+组小鼠。提示VSIG4 可抑制单侧输尿管梗阻小鼠的肾间质炎症反应和肾间质纤维化。 3.在VSIG4+/+组肾组织中TGF-β1表达随梗阻时间延长进行性增加；MMP-2表达在术后3天达峰值，此后逐渐减少；IL-2、IFN-γ、IL-10、TNF-α在术后表达均增加。VSIG4-/-组肾组织中术后上述指标变化更明显。提示VSIG4 可抑制巨噬细胞介导的肾小管间质炎症反应。 4.vsIG4 抑制肾组织中CD3+、CD4+、CD8+T细胞在炎症部位的浸润，抑制T细胞分泌IL-2及IFN-γ；但对巨噬细胞的浸润无明显影响。提示VSIG4 可能通过诱导T细胞无能而抑制肾小管间质炎症反应和纤维化。
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