雪莲细胞培养及二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因的分离克隆研究

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中文摘要：雪莲（Saussurea involucrata Kar et Kir）是一类名贵中草药，主要药用活性成分为黄酮类化合物。该文通过研究不同植物激素对雪莲愈伤组织诱导和分化的影响，探索不同植物激素和培养时间对雪莲愈伤组织生长量和总黄酮含量的影响，并分离了雪莲DFR基因片段，利用生物软件对DFR基因和蛋白质的结构和功能进行分析、预测。为基于愈伤组织所进行的遗传转化提供参考数据。主要研究结果如下： 1.雪莲种子萌发温度、培养基成分和渗透势显著影响雪莲种子的萌发，其中温度对雪莲种子萌发影响极显著，20/10℃变温条件下种子萌发率最高；渗透势和培养基成分对雪莲种子萌发影响显著，种子萌发的最适培养基为1/2MS0。聚乙二醇（PEG）高于-0.9MPa时，种子不能萌发。 2.植物激素对雪莲愈伤组织诱导和分化的影响植物激素对雪莲愈伤组织的诱导和分化影响显著。单因素诱导中，NAA的诱导效果显著优于其他激素，诱导效果：根>叶柄>叶片；NAA与6-BA激素组合诱导中，叶片与叶柄诱导率之间存在极显著性差异，而叶片与根，叶柄与根的诱导率之间存在显著性差异，诱导效果：叶片>叶柄>根。以叶片为外植体，最佳诱导培养基为MS+6-BA1.00mg/L+NAA2.00mg/L；最佳出芽培养基为MS+6-BA1.00mg/L+NAA0.20 mg/L；最佳生根培养基为1/2MS0+NAA0.30mg/L+KT0.03mg/L。 3.雪莲愈伤组织黄酮类化合物的测定研究继代培养基和培养时间对雪莲愈伤组织生长量、总黄酮含量和产量的影响，结果表明：（1）继代培养基以MS+NAA 2.00mg/L+6-BA1.00mg/L中愈伤组织生长量和总黄酮产量最高；以MS+NAA 4.00mg/L+6-BA2.00mg/L中的愈伤组织总黄酮含量最高；（2）愈伤组织生长量随继代培养时间的延长而增加，其总黄酮含量不稳定，在继代培养第30d达到最高。 4.雪莲DFR基因片段的分离克隆与序列分析通过降落PCR与梯度PCR相结合的方法，分离得到雪莲DFR基因片段长1464bp，分子量约为44Kda。分离得到的DFR基因片段与水母雪莲DFR基因的DNA（EF672726）高度相似，具有同源性。序列分析预测可以看出，DFR基因推导蛋白不存在卷曲螺旋结构，无信号肽，是一个跨膜的疏水性蛋白，高级结构中含有6个α-螺旋，3个?-片层。

作者：

庞红霞

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关键词：

雪莲愈伤组织植物激素总黄酮 DFR基因分离克隆

授予学位：

硕士

学科专业：

植物学

导师：

覃建兵

学位年度：

2010

学位授予单位：

新疆师范大学

语种：

中文

中图分类号：