摘要
目的： 胚胎干细胞(ESC)由于其无限增殖能力和多向分化潜能而在组织工程学研究领域备受瞩目。近年来,国内外学者大量报道将ESC成功诱导为肝脏、神经、心肌、胰岛以及造血细胞等,揭示ESC有望为细胞替代疗法提供新的细胞来源,用于治疗人类多种细胞、组织不可逆损伤所致的疾病。血友病(Hemophilia)是目前临床上最常见的先天性凝血障碍性疾病。其最主要的发病机制是由于凝血因子Ⅷ或/和Ⅸ(coagulation factor-Ⅷ or coagulation factor-Ⅸ,F-Ⅷ or F-Ⅸ)基因的突变或缺失,凝血因子Ⅷ、Ⅸ缺陷分别导致血友病A和B的发生,其临床症状的严重程度与血液循环中凝血因子Ⅷ、Ⅸ蛋白的水平密切相关。而表达凝血因子Ⅷ、Ⅸ的ESC源性肝细胞或可为血友病替代疗法提供新型种子细胞来源。尽管目前已成功在体外将ESC诱导分化为多种组织细胞,但由于对ESC分化的分子调控机制了解仍十分有限,因此,我们尚难以全面、有序地掌控ESC的分化的方向和进程,所获取的目的细胞在分化效率、均质性和功能等方面离临床应用尚相去甚远。ES细胞体外分化是人体组织细胞发育的体外重演,其中涉及了分化基因有序地激活与沉默、增强与衰减,而众多转录调节机制精确地控制这一进程,彼此间构成一个复杂的分子调控网络。小分子RNA(microRNA,miRNA)在干细胞分化中的调节作用是近年microRNA研究领域最受关注的热点之一。研究表明,microRNA与干细胞的自我更新、多能性维持、分化和分裂增殖等有关。 在本研究中,我们尝试将丁酸钠(sodium butyrate,SB)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和骨形态发生蛋白4(bone morphogeneticprotein4,BMP4)等多种诱导因子联合贯续应用,以期提高分化的效果和效率,获得更加接近成熟肝细胞的共表达凝血因子Ⅷ、Ⅸ的ESC源性肝细胞。在构建稳定的诱导分化平台的基础上,我们对ES细胞向肝细胞分化过程中的miRNA调控机制进行了研究,以期筛选出调控ES细胞向肝细胞分化的关键miRNA。此研究结果不仅有望为血友病细胞替代疗法提供新型的种子细胞来源,也为更深入的开展ESC体外分化机制研究奠定了基础。 方法： 小鼠E14胚胎干细胞早期在丁酸钠、骨形态发生蛋白4及碱性成纤维细胞生长因子联合作用诱导下分化为内胚层细胞和肝脏前体细胞,后期再在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、抑瘤素M(oncostatin M,OSM)和地塞米松(dexamethasone,DEX)作用下分化为成熟肝脏细胞。使用RT-PCR和realtime-PCR检测内胚层和肝脏的特异标志物(包括凝血因子Ⅷ、Ⅸ)在不同分化时间点的基因表达；Western Blot、免疫荧光及流式细胞法被用于检测蛋白的表达情况。在前期miRNA芯片检测结果的基础上,进一步进行Real Time PCR鉴定,筛选出miR-10a和miR-10b两个参与调控的关键miRNA,再通过抑制/增强及回复实验对其进行鉴定。 结果： 丁酸钠、bFGF、BMP4联合应用,可以在体外高效诱导小鼠ESC分化为共表达凝血因子Ⅷ、Ⅸ成熟肝脏细胞。在丁酸钠、bFGF、BMP4联合作用下,内胚层和肝脏的特异标志物均表达上调:凝血因子Ⅷ、Ⅸ在基因及蛋白水平的表达量也明显增加。 miRNA芯片结果显示miR-10a和miR-10b在ES细胞分化为肝细胞的初期呈高水平表达,且real-time PCR验证结果与芯片数据相吻合,结合生物学分析,初步推测miR-10a和miR-10b与肝细胞分化相关。在ES细胞分化早期对miR-10a和miR-10b的表达进行干预后,下游内胚层和肝细胞标志性基因表达水平随之发生变化,提示miR-10a和miR-10b可能参与了ES细胞向肝细胞分化的调控。 结论： 我们目前的研究证实了丁酸钠与bFGF、BMP4联合应用,可以在体外高效诱导小鼠ESC分化为共表达凝血因子Ⅷ、Ⅸ肝脏细胞,三者具有协同促进作用。我们在诱导培养的早期采用丁酸钠+bFGF+BMP4三因子联合诱导ESC分化为内胚层细胞和肝前体细胞,后期使用HGF、OSM及DEX继续诱导肝前体细胞分化为成熟肝细胞,由此建立了一种新颖有效的诱导ESC分化为肝细胞的培养体系,分化效果和效率得以提高,所获得的ESC源性肝细胞更加接近成熟肝细胞。在ESC向肝前体细胞分化过程中丁酸钠+bFGF+BMP4三因子的联合作用有助于肝细胞成熟表型的塑造,并促进凝血因子Ⅷ、Ⅸ于基因及蛋白水平的共表达。miR-10a和miR-10b可能在体外诱导ES细胞向肝细胞分化过程中起重要的调控作用,在诱导分化早期上调的miR-10a、miR-10b促进了ES细胞向肝细胞分化。 据我们所知,针对胚胎干细胞来源肝细胞同时表达凝血因子Ⅷ和凝血因子Ⅸ的报道,这是国际上第一次。本项目证实了共表达凝血因子Ⅷ、Ⅸ的ESC源性肝细胞在血友病替代疗法中的潜在价值,为将来的细胞体内移植实验提供了充足、安全的细胞来源,也为更深入的开展ESC体外分化机制研究奠定了基础。
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