摘要
目的:体外利用富集骨髓基质干细胞(BMSCs)复合纳米羟基磷灰石/胶原材料(简称nHAC)构建组织工程骨,将其应用于日本大耳白兔腰椎横突间融合模型,以探讨其用于脊柱融合的可行性及其潜在的临床应用价值。 方法:选用健康成年日本大耳白兔30只,随机分为3组,每组10只,第Ⅰ组(自体髂骨植入组),第Ⅱ组(骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/胶原植入组,即BMSCs/nHAC植入组),第Ⅲ组(单纯纳米羟基磷灰石/胶原植入组,即nHAC植入组)。无菌条件下抽取第Ⅱ组兔双侧髂后上嵴骨髓血,利用密度梯度离心原理富集骨髓血中的BMSCs,并测定富集后细胞活力,同时取部分细胞体外培养,通过细胞形态学和流式细胞术鉴定BMSCs。将富集BMSCs与nHAC体外复合构建组织工程骨,利用扫描电镜观察nHAC的形貌及富集BMSCs与nHAC的复合情况。经关节突外侧入路充分暴露腰5-腰6(L5-L6)横突,横突去皮质、暴露髓腔,第Ⅰ组再沿髂嵴做切口,取髂骨修剪成单面皮质骨条植入两侧L5-L6横突间,第Ⅱ组于L5-L6横突间植入BMSCs/nHAC复合物,第Ⅲ组于L5-L6横突间植入nHAC。术后8周取材L3-S1节段,行X线、三维CT、大体观察、融合节段活动度检查和组织学观察,评价L5-L6横突间融合情况。 结果:BMSCs富集后的细胞活力可达(92.5±2.0)%,所提取细胞体外培养7天时呈均匀一致的长梭形,传至第3代时流式细胞仪检测其表面CD44、CD90阳性,CD34、CD45阴性。扫描电镜观察:nHAC呈三维立体多孔结构,其间由具有纳米孔隙特征的内连孔沟通;富集BMSCs与nHAC复合后,BMSCs伸展成长梭形,伸出伪足粘附在nHAC的表面及孔隙内,细胞间的突起相互连接、融合呈桥状。X线检查结果示第Ⅰ组横突间组织块与横突连接处有连续骨小梁,组织块与周边骨组织密度均匀一致;第Ⅱ组横突间组织块与横突连接处骨小梁较连续,密度较均匀,块状物连续通过横突间隙,块状物密度稍低于周围骨组织;第Ⅲ组横突间组织块内部及其与横突连接处骨小梁不连续,密度不均匀,明显低于周边骨组织。三维CT结果与X线结果相似。大体观察见第Ⅰ组横突间植入骨块的表面有膜性软组织覆盖,骨块与横突接触部骨痂多,骨质连续,表面光整;第Ⅱ组横突间植入颗粒融合成块状,颗粒间间隙不清,组织块表面有膜性软组织包被,组织块与横突接触部骨痂较多,可见少量软组织;第Ⅲ组横突间植入颗粒内部及其与横突连接处有较多软组织嵌入,无明显骨痂形成。手触检测L5-L6节段第Ⅰ组7只兔融合,3只未融合;第Ⅱ组6只融合,4只未融合;第Ⅲ组1只融合,9只未融合。组织学观察见第Ⅰ组横突间组织块与横突连接处可见大量骨组织,新生的骨小梁连续;第Ⅱ组横突间组织块与横突连接处亦有较多骨组织,可见较连续的新生骨小梁,无明显纤维组织,块状物内部新生骨分布均匀,有少量纤维组织长入;第Ⅲ组横突间组织块与横突连接处有少量骨组织,骨小梁不连续,其间有较多纤维组织长入,块状物内部无明显新生骨组织,颗粒间被大量纤维组织分隔包绕。 结论: 1.密度梯度离心法是一种很有效的骨髓基质干细胞富集方法。 2.nHAC材料具有良好的细胞相容性,是BMSCs的良好载体,BMSCs可以在其表面及孔隙内良好的粘附、生长。 3.富集BMSCs复合nHAC构建的组织工程骨用于脊柱融合可获得近似自体骨的融合效果,避免了自体取骨的并发症,是一种具有良好应用前景的自体骨移植替代材料。
NETL