水稻纹枯病是水稻上的重要病害之一。近年来,水稻纹枯病的发生和为害日趋严重,给水稻生产造成了巨大的经济损失。本研究对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solaniKühn AG-1 IA)毒素和细胞壁降解酶这两类重要的致病因子及与致病性相关的内切多聚半乳糖醛酸酶基因1(rrspg1)等方面进行了研究,取得了如下结果: ⑴水稻纹枯病菌毒素的化学性质与活性成分鉴定。比较了4种生测方法的效果,结果表明:叶片漂浮浸渍法简单、方便,适合于水稻纹枯病菌毒素的生测。通过对毒素处理过的水稻叶片细胞膜电导率和渗漏还原糖的测定,进一步明确了毒素对水稻组织的损害作用。通过Molish反应、茚三酮试验和Fehling反应,确定了水稻纹枯病菌毒素含有糖类成分,不含有氨基酸或蛋白成分。采用GC/MS方法,检测到该毒素含有6种糖类组分,分别为核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,没有检测出文献报道的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺。采用LC/MS/MS方法,未检测到该毒素含有文献报道的苯乙酸及其衍生物成分。 ⑵水稻纹枯病菌细胞壁降解酶SDS-PAGE、活性测定及致病性分析。对水稻纹枯病菌细胞壁降解酶进行了SDS-PAGE电泳分析,结果显示:至少有10条清晰条带,说明提取的细胞壁降解酶至少含有10种不同分子量的组分。测定了7种常见细胞壁降解酶的活性,结果显示:PG活性最强,Cx和PMG酶次之。通过比较不同底物对PG、Cx和PMG这三种主要细胞壁降解酶的诱导效果,发现Cx酶用1%CMC的诱导效果最好,PG和PMG用1%果胶的诱导效果最好。从温度、反应时间和pH值三个方面探索了PG、Cx和PMG这三种主要细胞壁降解酶最佳酶活测定条件,发现:Cx的最佳反应温度是30℃,PG和PMG的最佳反应温度是50℃;Cx和PMG的反应时间定为40min较为合适,PG反应时间定为60min较为合适;当pH值达到5.0时PG酶活性最大,当pH值达到9.0时Cx酶活性最大,pH值为4.0~6.0时,PMG的酶活性达到最大。通过叶片浸解后的渗透性还原单糖和相对电导率的测定,结果表明:细胞壁降解酶对水稻叶片组织具有损伤作用,随着酶浓度增加,损伤程度逐渐加大。 ⑶水稻纹枯病菌转化体系构建及pTHPR1转化子生物学特性的研究。以水稻纹枯病菌强致病力菌株GD118为研究对象,分别从酶种类、菌龄、酶解时间、酶解温度、酶液pH值和渗透压稳定剂及其浓度6个方面优化了原生质体的制备条件,从酶解时间和渗透压稳定剂及其浓度2个方面优化了原生质体的再生条件。结果表明:优化后的原生质体制备的最佳条件组合是:“纤维素酶+溶菌酶+崩溃酶”组合酶、总酶终浓度10mg/mL、15h菌龄的菌丝、酶解时间3h、酶解温度35℃、酶液pH5.6、以0.6mol/LMgSO4·7H2O作渗透压稳定剂;而原生质体最佳的再生条件是:酶解3h的原生质体在含1.0mol/L甘露醇的再生培养基上培养,可获得最佳的再生效果。以水稻纹枯病菌强致病力菌株GD118为出发菌株,以含潮霉素抗性基因的pTHPR1为转化质粒,从预诱导时间、共培养时间、共培养时AS的浓度、共培养温度和共培养时ISM培养基的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于R.solaniAG-1IA进行根癌农杆菌介导的转化的最优化系统:以30μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8h,共培养20h,共培养时ISM的AS浓度为200μmol/L,共培养温度25℃,共培养时ISMpH5.6~5.8。采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性。从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出了500bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带,而10个转化子均未能扩增出相应条带。以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明:T-DNA确实已经插入到目标菌株GD118中。在上述研究的基础上,从温度、pH值、碳源、氮源和光照5个方面比较了10个pTHPR1转化子与野生型菌株(GD118)在生物学特性方面的差异,明确了水稻纹枯病菌转化后导致生长速度、菌核颜色、菌核数目等方面发生改变的程度,为研究水稻纹枯病菌菌丝生长及菌核形成调控因子及相关基因克隆奠定了基础。 ⑷水稻纹枯病菌rrspg1基因的克隆、序列分析与RNAi分析。利用NCBI网站()上公布的endo-PG基因同源序列,设计并筛选到了扩增rrspg1基因的有效引物,通过PCR和RT-PCR方法,扩增、克隆并测定了水稻纹枯病菌不同致病力菌株rrspg1基因的gDNA和cDNA序列,研究了其亲缘关系与致病力之间的关系。结果表明:三个致病力等级的水稻纹枯病菌7个菌株分别处于亲缘关系进化树的三个分枝上,即致病力相近的菌株其endo-PG基因的亲缘关系较近,说明水稻纹枯病菌endo-PG是该病菌的一个重要致病因子。通过RT-PCR和RACE技术,获得了rrspg1基因的cDNA全长序列,并找出了其对应的内含子、ORF、5’-UTR和3’-UTR序列。根据已获得的rrspg1基因序列,设计了特异引物,扩增了500bp左右的基因序列,成功地构建了用于沉默水稻纹枯病菌rrspg1基因的RNAi表达载体pSilent-PG-2,并通过hph基因引物扩增、rrspgl基因特异性引物扩增、双酶切等方法确定了该载体已正确连接。用PEG方法对水稻纹枯病菌成功地进行了pSilent-PG-2的遗传转化,对获得的转化子通过hph基因序列扩增证明该沉默载体确实已经插入到转化子中。通过对转化子和野生型菌株的PG酶活性测定,发现该RNAi载体对rrspgl基因的平均沉默效率为71.05%。