壳聚糖是至今发现的唯一天然碱性多糖,在医疗、纺织、食品、保健、印染、化妆品、废水处理等领域具有广泛的应用价值,以及巨大的产品开发和市场推广能力。甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,E.C.3.5.1.41)是催化甲壳素转变为壳聚糖的重要生产酶,它通过催化N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脱去乙酰基将甲壳素转变为壳聚糖,其主要存在于结合菌纲的真菌中。利用它代替现在普遍采用的浓碱热解法生产壳聚糖,这既可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题,又可以生产出高质量的壳聚糖产品。本论文从自然环境中筛选到甲壳素脱乙酰酶高产细菌 Z7。并对该菌株进行了产酶发酵条件优化及酶学基本性质研究,为以后的甲壳素脱乙酰酶工业化生产奠定了良好的基础。研究结果如下: (1)甲壳素脱乙酰酶高产菌株筛选鉴定。本研究利用对硝基-N-乙酰苯胺为显色剂,从河滩、海滩以及虾蟹加工厂废墟的土壤中筛选到产甲壳素脱乙酰酶菌株36株,根据显色能力的差异筛选到产甲壳素脱乙酰酶能力较强的菌株9株。通过进一步的发酵复筛,得到一株甲壳素脱乙酰酶高产菌株Z7,中南林业科技大学菌种保藏号为 CSUFT F14。根据伯杰氏菌种鉴定手册和16s rDNA序列分析鉴定,菌株Z7为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。 (2)甲壳素脱乙酰酶高产菌株发酵条件优化。利用单因素法研究了菌株 Z7的摇瓶分批发酵培养条件。菌株Z7产甲壳素脱乙酰酶的最佳培养条件为:种龄10h,培养温度为37℃,pH6.0,摇床转速为160r/min,装液量为20％,培养时间28h。利用Plackett-Burman实验与响应面实验结合的方法,得到该菌株产酶的最佳发酵培养基配方:甲壳素10g/L,淀粉25g/L,酵母浸膏10g/L,硫酸镁0.25g/L,磷酸二氢钾0.3 g/L,氯化钠5 g/L,此条件下酶活水平达到27.48U/mL。本文利用菌株Z7在最佳发酵培养基中,酶活力与生长曲线的关系,确定菌株Z7发酵类型为生长关联型。 (3)甲壳素脱乙酰酶高产菌株酶学基本性质研究。对菌株Z7所产的甲壳素脱乙酰酶基本酶学性质研究表明:该酶最适作用温度为40℃,最适pH值为6.5,在1mmol/L的浓度下,Mg2+、K+、Ca2+和Fe2+离子对其有一定的激活作用,其中Mg2+的激活作用最强,pb2+、Cu2+和Mn2+对酶具有抑制作用,其中Mn2+有强烈的抑制作用。
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