摘要
人体内的血栓常引发严重的心血管疾病,发病突然,死亡率极高,溶栓治疗是抢救与治疗此类疾病的常用手段。纤溶酶则能分解血栓的主要骨架纤维蛋白从而溶解血栓,以恢复血流通畅、促进组织恢复。该酶在发挥溶栓作用时,不水解血浆纤维蛋白质,故不易引起出血倾向。因此纤溶酶具有广阔的研究开发前景。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一。能使外源真核基因正确地翻译和翻译后加工,并能对许多蛋白质产物进行分泌,使产物易于提纯。目前毕赤酵母工程菌摇瓶培养所采用的培养基价格昂贵,本试验在前期已构建产纤溶酶的基因工程菌菌株基础上,对产纤溶酶毕赤酵母基因工程菌的培养基进行探索研究,找到了一种廉价的培养基配方,降低了纤溶酶的生产成本,并对其液体发酵条件进行优化及10L发酵罐的放大试验。 本文在摇瓶发酵水平上,对产纤溶酶毕赤酵母工程菌菌株pk53研究了不同碳源、氮源、磷酸盐、金属离子、表面活性剂等因素对毕赤酵母工程菌菌株pk53产酶的影响,发现麸皮、豆粕粉、磷酸二氢钾浓度对产酶的影响较大。对麸皮、豆粕粉、磷酸二氢钾三因素各选取三个水平进行正交试验,利用单因素试验和正交试验确定确定了其最佳培养基成分。确定该菌株的适宜廉价发酵培养基为:麸皮1.5％,豆粕粉2.0％,KH2PO40.5％,MgSO4·7H2O0.05％；分别考察了接种量、甲醇添加量、起始pH值、诱导pH值、装液量等发酵条件对菌株产酶的影响,确定其最佳培养条件为:接种龄14 h,接种量1％,甲醇添加量1.5％,培养基装液量30 mL(250mL三角瓶),生长pH为5.5,诱导pH为6.0；设计正交试验来综合考虑甲醇添加量、诱导pH、培养基起始PH、装液量四个因素对产酶的影响。结果发现极差值R装液量>R甲醇添加量>R诱导pH>R初始pH,根据单因素及正交试验结果,确定发酵条件优化配比为:装液量30 mL、甲醇添加量1.5％、诱导pH6、初始pH5.5。在此条件下培养,最大酶活为1841.28 U/ml,是出发菌株酶活力的3.02倍,且产酶高峰提早1天。以摇瓶发酵试验为基础,进行了10L发酵罐的放大试验,测定了包括相对溶氧值、pH值、总糖、还原糖、蛋白质、纤溶酶活性在内的代谢情况,为其工业化生产打下了基础。
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