摘要
1885年,德国科学家T.Escherich首次发现大肠杆菌O157:H7,它是引起腹泻的重要致病菌。大多数食物中毒都可追溯到牛肉和未消毒的牛奶,而且感剂量小于100个细菌即可引起感染。目前对大肠杆菌O157:H7的检测方法主要有传统的常规培养法、免疫学检测方法和以PCR为代表的分子生物学检测方法。传统方法操作繁琐,检测时间长,而且灵敏度较低；免疫学检测方法特异性和灵敏度不理想；PCR方法敏感、快速,但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,难以在基层普及和推广。采用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,检测食品中的大肠杆菌O157:H7,具有灵敏度高,特异性强,检测方法简便,耗时短,检测成本低等特点,适宜在基层普及和推广。 本研究针对大肠杆菌O157:H7(IQCC10102)rfbE保守序列(Genbank S83460),运用在线引物设计软件()设计LAMP引物。对BST酶添加量、dNTP浓度、镁离子浓度等扩增条件进行了优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.6μM,外引物(F3和B3)各0.2μM,环引物(LB)0.8μM,0.6mM dNTP,3.0mM MgCl2,10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8U Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和灭菌双蒸水。LAMP反应过程是:64℃水浴锅中反应20min,然后将其放入80℃水浴锅中,水浴10min终止反应,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀,判断是否发生LAMP反应。 为了比较LAMP检测大肠杆菌O157:H7灵敏度和人工污染的检出限,以PCR方法作对照。PCR引物是LAMP的两条外引物(F3和B3)。结果表明:LAMP检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度为9.8 CFU/mL,人工污染牛肉的检出限为68CFU/g。PCR检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度为980CFU/mL,人工污染牛肉的检出限为6.8x103CFU/g。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法约耗时2h,PCR方法约耗时3h。利用LAMP方法对19株肠道致病菌进行特异性试验。结果表明:三株大肠杆菌O157为阳性,其他16株菌均为阴性。 初步研究了3种模板制备方法对LAMP检测牛肉中大肠杆菌O157:H7的影响。结果表明,LAMP方法对制备模板DNA的要求不高。 研究表明:LAMP技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测技术,在大肠杆菌O157:H7的快速检测方面有一定开发潜力,为快速检测食源性致病菌构建了一个新的技术平台。
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