摘要
目的：血管性痴呆(VD)指的是由脑血管病引起的有痴呆表现的临床综合征。随着世界人口老龄化，VD发病率、致残率、病死率均有升高，已成为威胁高龄人群健康的重要疾病之一，因此积极研究探索VD的发病机制及其治疗有重要的医学价值和社会意义。中药清脑胶囊是依据中医药理论，以活血化瘀，化痰开窍为治疗法则，结合多年临床用药经验研制而成，临床用于VD治疗取得很好的疗效。为探讨清脑胶囊治疗VD的作用机制，本实验采用VD小鼠模型及PC12细胞缺氧模型，研究了清脑胶囊对VD小鼠脑内单胺递质的含量及PC12细胞缺氧损伤的影响，初步探讨其治疗VD的疗效及可能的作用机制。 方法： 1.清脑胶囊对VD小鼠脑内单胺递质的影响采用反复缺血再灌注方法制备VD小鼠模型。选取造模成功的小鼠分为模型对照组、清脑胶囊低剂量组（3.4g生药/kg）、清脑胶囊中剂量组(6.8g生药/kg)、清脑胶囊高剂量组(13.6g生药/kg)及阳性药喜得镇组(1.5mg/kg)，另设假手术组（手术及麻醉同模型组，但双侧颈总动脉不夹闭，尾部不放血），每组10只（模型组死亡1只），每日灌胃给药1次，给药容量为0.2mL/10g，连续给药4周，假手术组与模型对照组灌服纯水。 1.1 学习记忆能力检测于第1周、第2周、第3周、第4周灌胃给药1小时后，应用Morris水迷宫对各组小鼠的学习记忆能力进行测试：定位航行实验中计录并比较各组小鼠逃避潜伏期、游泳路径的平均值、朝向角；空间搜索实验中计录并比较穿越平台的次数、平台象限的游泳时间与总游泳时间的比值、平台象限的游泳距离占总游泳距离的比值及朝向角。 1.2 单胺递质检测于第4周行为学测试完毕断头取脑，应用荧光分光光度法检测并比较各组小鼠脑内单胺类递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量。 2.清脑胶囊及其含药血清对PC12细胞缺氧损伤的影响 2.1 清脑胶囊对PC12细胞缺氧损伤的影响 2.1.1 清脑胶囊对PC12的细胞毒性检测药物浓度梯度设定为1μg．L-1、10μg.L-1、100μg.L-1、500μg.L-1、1000μg．L-1、5000μg.L-1、10000μg.L-1、50000μg.L-1，作用时间为24h;MTT法测定各孔PC12细胞的增殖活性，以OD值表示。 2.1.2 清脑胶囊最佳作用浓度与作用时间的确定清脑胶囊工作液作用浓度为如下浓度：10μg.L-1、50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1、500μg．L-1、1000μg.L-1、2500μg.L-1，连二亚硫酸钠终浓度为5mmol·L-1造模，在缺氧损伤发生16h后，与药物共培养预孵育时间1、4、24h;采用MTT法进行测定，确定药物抑制损伤的最佳作用浓度与作用时间。按本实验确定的浓度为50μg.L-1、100μg.L-1、250μg.L-1，时间为24h;将对数生长期的PC12细胞分为模型对照组、50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1清脑胶囊组、无血清对照组。连二亚硫酸钠造模损伤16h后，观察各剂量组细胞形态，采用MTT比色法、LDH活力测定法，比较各组对该模型的影响。 2.2 清脑胶囊含药血清对PC12细胞缺氧损伤的影响将对数生长期的PC12细胞分为模型对照组、5%含药血清低、中、高剂量组、空白血清对照组，共5组。连二亚硫酸钠造模损伤16h后，观察各组细胞形态，采用MTT比色法、LDH活力测定法，比较含药血清各组对该模型的保护作用。 结果： 1.清脑胶囊对VD小鼠脑内单胺类递质的影响 1.1 定位航行实验与同一时间点的假手术组相比，模型组小鼠逃避潜伏期均显著延长(P＜0.01)，游泳路径的平均值、朝向角均显著增大(P＜0.01)；与同一时间点的模型组相比，清脑胶囊中剂量组（6.8g生药/kg）及清脑胶囊高剂量组(13.6g生药/kg)组逃避潜伏期均缩短(P＜0.05或P＜0.01)，游泳路径的平均值、朝向角均减小(P＜0.05)；清脑胶囊低剂量组（3.4g生药/kg）各项指标均有改善趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。 空间搜索实验：与同一时间点的假手术组相比，模型组穿越平台次数显著减少(P＜0.01)，平台象限的游泳时间与总游泳时间的比值、平台象限的游泳距离占总游泳距离的比值均显著减小(P＜0.01)，朝向角显著增大(P＜0.01)；与同一时间点的模型组相比，清脑胶囊中剂量组(6.8g生药/kg)及清脑胶囊高剂量组（13.6g生药/kg）穿越平台次数明显增多(P＜0.05或P＜0.01)，平台象限的游泳时间与总游泳时间的比值、平台象限的游泳距离占总游泳距离的比值均明显增大(P＜0.05或P＜0.01)，朝向角明显减小(P＜0.05或P＜0.01)；清脑胶囊低剂量组(3.4g生药/kg)各项指标均有改善趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。 1.2 单胺类递质检测与假手术组相比，模型组小鼠脑组织中的NE、DA、5HT三种单胺递质含量均显著下降(P＜0.01)；与模型组相比，清脑胶囊中剂量组(6.8g生药/kg)及清脑胶囊高剂量组(13.6g生药/kg)组小鼠脑组织中的NE，DA、5-TH含量明显增高（P＜0.05或P＜0.01）；清脑胶囊低剂量组(3.4g生药/kg)较模型组三种单胺递质均有升高趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。 2.清脑胶囊及其含药血清对PC12细胞缺氧损伤的影响 2.1 清脑胶囊对PC12细胞缺氧损伤的影响 2.1.1 清脑胶囊对PC12的细胞毒性检测清脑胶囊工作液浓度达到10mg.mL-1时，OD值较正常对照组显著降低(P＜0.01)，多数细胞肿胀，折光度减弱，最终细胞成团、漂浮，镜下可见许多细胞崩解物，提示药物浓度大于10mg.mL-1时，出现明显细胞毒作用。 2.1.2 清脑胶囊最佳作用浓度与最佳作用时间的确定与无血清对照组相比，模型组OD值显著降低(P＜0.01)；与模型组比，50μg.L-1预孵育24h;100μg.L-1预孵育4h、24h;250μg.L-1预孵育1h、4h、24h;500μg.L-1预孵育4h可使OD值明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；10ug/L组预孵育1h、4h、24h;50μg.L-1预孵育1h、4h;500μg.L-1预孵育1h、24hOD值有升高趋势，但无统计学意义(P＞0.05)。分析可知：清脑胶囊对PC12细胞缺氧损伤的最佳作用浓度为50μg．L-1、100μg．L-1、250μg.L-1；最佳预孵育时间为24h。 2.1.3 细胞形态学观察正常对照组PC12细胞细胞呈圆形，较少有突起，为贴壁细胞，折光性较强；模型组多数细胞肿胀，折光度减弱，最终细胞成团、漂浮，并有许多细胞崩解物，50μg.L-1、100μg.L-1、250μg．L-1三组较模型组细胞数量较多，折光性明显增强，细胞裂解碎片减少，多数细胞重新贴壁伸展。 2.1.4 MTT法测定各组细胞活性与正常对照组相比，模型组OD值显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，清脑胶囊50μg．L-1、100μg.L-1、250μg.L-1组预孵育24h，OD值明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。 2.1.5 LDH活力测定与正常对照组相比，模型组LDH漏出量显著增大(P＜0.01)；与模型组相比，清脑胶囊50ug.L-1、100μg.L-1、250μg.L-1组预孵育24h，LDH漏出量明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，与MTT法结果一致。 2.2 清脑胶囊含药血清对PC12细胞缺氧损伤的影响 2.2.1 MTT法测定各组细胞增殖活性与空白血清对照组相比，模型组OD值显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，5%含药血清中、高剂量组OD值显著升高(P＜0.01)，5%含药血清低剂量组OD值有升高趋势但无统计学意义(P＜0.05)。 2.2.2 LDH活力测定与空白血清对照组相比，模型组LDH漏出量显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，5%含药血清中、高剂量组LDH漏出量显著降低(P＜0.01)，抑制率分别为40.5%，31.1%；5%含药血清低剂量组LDH漏出量明显降低(P＜0.05)，抑制率为22.4%；与MTT法结果一致。 结论： 1.清脑胶囊能够显著改善VD小鼠的学习记忆能力，其可能作用机制为提高VD小鼠脑内单胺递质NE、DA、5-HT的含量。 2.清脑胶囊及其含药血清均能提高Na2S2O4所致缺氧损伤PC12细胞的活力、抑制其培养介质中LDH活性；对PC12细胞缺氧损伤具有保护作用。
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