摘要
第一部分、肝脏组织工程纳米支架材料的选择及其功能评估 目的:比较不同纳米材料在体外对肝细胞生长的影响,为肝脏组织工程寻找合适的支架材料。 方法:用静电纺丝的方法将壳聚糖、海藻酸钠及PLGA制备成纳米纤维支架,同时采用经典的两步原位胶原酶灌注法分离大鼠肝细胞,检测肝细胞在不同纳米支架材料表面的活性及粘附情况,选出最适合的支架材料,并进一步研究肝细胞在其表面的功能表达情况。 结果:肝细胞在壳聚糖纳米纤维支架表面展示了良好的活性,并能与支架材料紧密结合。其尿素合成、蛋白分泌及细胞色素P450的活性均为对照组的1.5～2倍,糖原合成也较对照组有明显增强。 结论:壳聚糖纳米纤维支架能促进肝细胞粘附,同时具有良好的生物相容性,从而促进肝细胞的功能,是生物反应器中肝细胞粘附介质的理想材料。 第二部分、乳糖酰基壳聚糖纳米支架材料的制备及其对肝细胞生长的影响 目的:在壳聚糖纳米支架材料表面接枝半乳糖基团,从而进一步促进肝细胞在材料表面的活性及粘附效率。 方法:以天然聚合物壳聚糖、乳糖酸为原料,通过EDC(1-乙基-3-(3-甲氨丙基)碳亚胺盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)交联剂活化,使壳聚糖分子中的氨基与乳糖酸的羧基反应,冷冻干燥,制成乳糖酰基壳聚糖,再通过静电纺丝,制备成纳米材料。利用红外光谱、核磁共振对合成的物质进行理化性质的测定,并在材料表面接种原代肝细胞,通过测定细胞活性及功能,了解乳糖酰基壳聚糖纳米支架材料对细胞生长的影响。 结果:各项理化性能检测结果表明,合成的乳糖酰基壳聚糖纳米支架材料具有良好的孔径分布及稳定的机械强度。培养肝细胞之后发现,细胞在接枝的纳米材料表面形成聚集体,极大地促进了细胞的功能,而在普通纳米材料表面则没有聚集体形成;另一方面,虽然细胞在接枝的普通材料表面也能形成球聚体,但该球聚体很容易脱落,其粘附效率不如接枝的纳米材料。 结论:乳糖酰基壳聚糖纳米支架在保证细胞粘附率的基础上,使细胞形成聚集体生长,从而进一步促进了细胞的功能,有望应用于生物反应器,解决反应器中细胞容易脱落且功能不高的问题。 第三部分、新型生物反应器的构建及其体外功能评价 目的:为体外生物人工肝支持系统构建一种新型的多层平板型生物人工肝细胞反应器,并在其中引入乳糖酰基壳聚糖纳米支架材料和红细胞携氧,从而提高反应器中细胞的活性及功能。 方法:自主设计组装一种新型的多层平板型生物反应器,平板表面采用静电纺丝纺上一层乳糖酰基壳聚糖纳米纤维膜,新鲜分离的原代猪肝细胞接种于纳米纤维支架表面,用含有红细胞的培养液进行循环式培养。定期检测反应器中氧供及细胞的活性和功能,观察细胞与纳米材料结合情况,与对照组进行比较。 结果:扫描电镜显示,反应器中的细胞能与纳米支架材料很好的结合。与对照组相比,新型反应器中的细胞粘附率是其1.59倍,而白蛋白分泌能力及尿素合成能力则分别为1.73倍和2.86倍。培养过程中,实验组反应器中仅有少量的酶(AST、LDH)漏出,明显低于对照组。同时,实验组反应器中肝细胞氧耗率为对照组的1.91倍,葡萄糖消耗为对照组的2倍。 结论:初步构建的新型多层平板型生物反应器,符合生物人工肝基本的要求。乳糖酰基壳聚糖纳米支架材料的引入能极大地促进肝细胞在其内的活性及功能;而红细胞的加入,则进一步增强了反应器中肝细胞的氧供。总之,我们的反应器展现了良好的性能,因而有望应用于生物人工肝。
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