摘要
家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为了探索从分子改良上对家蚕进行遗传改造,本研究利用家蚕丝素轻链基因终止密码子TAA上游约1.2 kb片段和TAA下游约0.5 kb片段作为基因打靶的左右同源臂,将缺少启动子驱动的绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到两同源臂的中间,构建获得基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。然后将该载体转染BmN细胞,通过绿色荧光检测,证明载体构建有效。通过精子介导法将该载体导入家蚕卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕；western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为70 kDa的GFP-Fib.L融合表达蛋白的特异性条带。研究结果表明通过基因打靶将外源基因导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。 同时,本研究利用家蚕丝素轻链序列的第5～7外显子片段(约1.2 kb)和第7外显子及其侧翼序列片段(约0.5 kb)作为基因打靶的左右同源臂,将gfp基因和人工合成的家蚕抗菌肽基因(cec)融合克隆到两同源臂之间,并从设计上将gfp-cec基因融合到丝素轻链基因；将由ie-1驱动的DsRed基因表达盒克隆在右侧同源臂的外面,作为负选择标记,构建了在结构与功能上与上述不同的另一个基因打靶转基因载体pSK-Fib-L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。将该载体转染细胞进行功能验证,发现转基因细胞中存在只有绿色荧光而无红色荧光的细胞,表明载体构建成功；再将该载体用精子介导转入家蚕卵,对呈绿色荧光的个体进行鉴定。初步获得了能产生绿色荧光抗菌丝的转基因家蚕。研究为探索通过分子改良,对家蚕进行遗传育种提供了新的思路。 研究过程中,通过RT-PCR方法获得了家蚕JAK／STAT途径中的信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)2的cDNA基因(BmSOCS-2A),测序结果表明,该792 bp片段含有完整的ORF,由4个外显子组成,编码263个氨基酸残基,分子量为28.8 kD。结构分析显示BmSOCS-2A有5个α螺旋结构,存在典型的SH2结构域和SOCS结构域。基因芯片数据分析结果显示,BmSOCS-2在家蚕雌雄性腺组织中表达量最高。进化分析表明,SOCS以不同种类聚类在一起,表明各种SOCS基因在各昆虫物种形成前就已产生SOCS基因家族。
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