橡胶树抗旱、抗寒相关基因克隆及表达分析

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中文摘要：橡胶树是多年生热带经济作物。随着橡胶树种植由传统植胶区向非传统植胶区拓展，橡胶树不可避免地遭受非生物逆境胁迫，如台风、干旱和低温等。培育橡胶树抗逆品种是包括我国植胶区在内的非传统植胶区的迫切需要。目前，我国橡胶树抗逆品种少，其主要原因是橡胶树杂交育种周期长，对抗逆性状的鉴定依赖前哨苗圃鉴定，缺乏用合适的分子标记进行抗逆性状的早期选择技术。本研究基于其他植物抗寒和抗旱机制的研究成果，从PEG诱导的橡胶树叶中克隆与抗旱和抗寒有关的MT、DREB和CDPK家族的成员，并分析它们的表达模式，旨在为橡胶树抗旱和抗寒相关的分子标记研发提供理论依据。主要研究结果如下： 1.采用RT-PCR结合RACE技术，克隆了巴西橡胶树MT，DREB和CDPK家族各1个成员的全长cDNA，HbMT2α，HbDREB2和HbCDPK1。其中，HbMT2α全长为372bp，包含237bp的开放阅读框，55 bp的5’非编码区和88 bp的3’非编码区，编码的蛋白含78个氨基酸，理论分子量为7.8kDa；HbDREB2全长为1138bp，包含810bp的开放阅读框，7bp的5’非编码区和321bp的3’非编码区，编码的蛋白含269个氨基酸，理论分子量为29.98kDa；HbCDPK全长为1845bp，包含1593bp的开放阅读框，120bp的5’非编码区和121bp的3’非编码区，编码的蛋白530个氨基酸，理论分子量为60.15kDa。同时还扩增了HbMT、HbDREB和HbCDPK家族的其它成员(HbMT2b、HbDREBJ1、HbCDPK2，HbCDPK3、HbCDPK4、HbCDPK5、HbCDPK6、HbCDPK7)的部分阅读框和3端非编码区。 2.生物信息学分析表明，HbMT2α具有富含Cys的两个结构域，N端为β结构域，含有C-C、C-X-C和C-X-X-C单元；C端为α结构域，含有C-X-C单元。HbDREB2含有高度保守的AP2结构域，由大约59个氨基酸组成，包含YRG和RAYD两个保守元件，C端还含有特定的KYPSxEIDW序列；HbCDPK1从氨基酸序列的N端到C端，存在4个典型的结构域，即N末端可变区、蛋白激酶结构域、自抑区和类钙调蛋白结构域(含有4个EF手型结构域)。HbDREB2含有DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件的中心序列(CCGAC)。 3.成功构建了PET28a(+)-HbMT2a的原核表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，得到了His-HbMT融合蛋白。用重金属Zn2+和Cu2+胁迫含PET28a(+)和含PET28a(+)-HbMT的E.coli BL21(DE3)菌株的生长，对前者的抑制明显强于后者，表明HbMT2α具有抗重金属毒害的功能。H2O2能诱导HbMT2α迅速大量表达，表明HbMT2α具有消除活性氧的功能。PEG、低温和一些激素都能诱导HbMT2α的表达量上升。在10℃低温条件下，HbMT2α在抗寒的橡胶树品种93-114中表达量低，且相对稳定，但在不抗寒品种热垦501中，低温处理6小时导致该基因上调10倍以上。因此，该基因的表达量有望作为筛选抗性种质的一个指标。 4.在10℃低温条件下，6h后HbDREB2在抗寒性强的橡胶树品种93-114中的表达量明显高于不抗寒品种热垦501。HbDREB2表达量有望作为筛选抗寒种质的一个指标。此外，PEG、ABA、Me-JA都能诱导HbDREB2上调表达。重金属离子对HbDREB2的表达没有影响。 5.在10℃低温条件下HbCDPK1和HbCDPK6在抗寒性强的品种93-114和不抗寒品种热垦501中的表达模式不同：HbCDPK1在93-114中持续上调表达，且表达量显著高于在热垦501中的表达量；HbCDPK6在93-114中表达量低，且相对稳定，但在热垦501中，低温处理后6h，表达量上调10倍以上。

作者：

李言

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关键词：

巴西橡胶树 HbMT2基因 HbDREB基因 HbCDPK基因抗旱性能抗寒性能辅助育种

授予学位：

硕士

学科专业：

植物分子遗传学

导师：

田维敏

学位年度：

2011

学位授予单位：

海南大学

语种：

中文

中图分类号：