摘要
目的:食管胃底静脉曲张是门脉高压症的严重并发症,一旦破裂可造成大出血,危及患者生命。普萘洛尔(心得安)是目前预防肝硬化静脉曲张破裂出血的最常用药物,需要长期、足量给药。但肝硬化病人长期服用普萘洛尔是否会对患者肝星状细胞活化及肝纤维化产生影响,目前尚不得而知。而对肝硬化有无促进或抑制作用是给肝硬化患者长期服药时需要考虑到的问题。 本研究以肝纤维化的关键细胞一肝星状细胞为研究对象,采用细胞培养和分子生物学技术,观察β-受体阻滞剂普萘洛尔对人肝星状细胞(Hepatic StellateColI,HSC)的增殖、凋亡以及致肝纤维化作用的影响,目的是探讨普萘洛尔对肝星状细胞形态和功能的影响,从而阐明肝硬化患者长期服用普萘洛尔对肝纤维化有无潜在的促进或抑制作用。 方法:采用HSC-LX2肝星状细胞系作为活化肝星状细胞的研究模型,在培养的肝星状细胞中分别加入不同浓度的盐酸普萘洛尔(10μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1),于24小时收集细胞,观察HSC的生长情况。采用水溶性四唑盐-1(Water-Soluble Tetrazolium-1,WST-1)细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测不同药物浓度下肝星状细胞的增殖情况,流式细胞仪(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)检测细胞凋亡情况。提取细胞蛋白成分,用Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)表达水平。提取细胞培养液上清,用酶联免疫吸附测定(Enzyme LinkedImmunosorbent Assay,ELISA)法检测转化生长因子-β1(Transforming GrowthFactor-β1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)以及胶原Ⅰ、Ⅲ的表达水平。数值用均值±标准差(x±s)表示,不同组间结果的比较用单因素方差分析(One-way ANOVA),两个组之间的比较采用最小显著差(the Least Significant Differenee,LSD)t检验,P＜0.05为差异有显著性。 结果:采用WST-1试剂盒检测HSC增殖情况,普萘洛尔可抑制HSC的增殖,且随药物浓度增高,其抑制作用逐渐增强,抑制率由35.51%逐渐上升至95.74%。FACS法检测细胞凋亡,普萘洛尔可促进HSC的凋亡,且呈剂量依赖性,随普萘洛尔浓度增加,HSC凋亡率逐渐升高,各组依次为54.97±0.86%、57.17±1.15%、66.30±1.11%和81.96±1.72%,与对照组相比均有统计学差异。采用Western blotting法检测HSC表达α-SMA.的水平,普萘洛尔处理组细胞α-SMA的表达水平(四组灰度比值依次为0.6771±0.0064、0.6899±0.0185、0.6271±0.0091和0.5951±0.0219)明显低于正常对照组(0.7550±0.0157)和生理盐水组(0.7439±0.0165),具有显著性差异,且与剂量具有相关性。采用ELISA法检测细胞培养液中TGF-β1、MMP-2以及胶原Ⅰ、Ⅲ的表达水平,普萘洛尔可浓度依赖性地抑制HSC分泌TGF-β1、MMP-2以及胶原Ⅰ、Ⅱ的水平。 结论: 1.普萘洛尔可使HSC-LX2的活化、增殖受到明显抑制,且呈浓度依赖性,其发挥作用可能是通过与β-AR结合实现的。 2.普萘洛尔可使HSC-LX2的凋亡率明显升高,且呈浓度依赖性,提示普萘洛尔可能通过与β-AR结合促进HSC凋亡。 3.普萘洛尔可浓度依赖性地抑制HSC-LX2表达α-SMA和分泌TGF-β1、MMP-2以及Ⅰ、Ⅲ型胶原。 上述结果提示肝硬化患者长期服用普萘洛尔可能具有减缓肝纤维化、抑制细胞外基质产生并继而降低肝窦内阻力的作用。
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