作物小孢子培养是现代分子育种中的常规技术之一。而传统的诱变育种技术成功在多种作物中获得了早熟、矮化、抗逆、高产、优质等性状的突变体。将现代分子育种的小孢子培养和紫外线诱变技术结合是诱变育种的新趋势。油菜小孢子材料经诱变后,直接染色体加倍,能获得纯和突变基因的育种材料,大大加快育种进程,是解决我国甘蓝型油菜遗传种质资源匮乏的有效手段之一。本研究探讨了在大田条件下影响小孢子出胚率的因素及小孢子再生植株继代和移栽技术；利用流式细胞仪对小孢子再生植株进行DNA含量的测定以及倍性的鉴定,并在田间种植观察验证;比较秋水仙碱直接处理小孢子和单倍体植株浸根加倍,观察染色体加倍效果及后期植株生长发育情况;确定紫外线诱变油菜小孢子的半致死剂量及筛选油菜耐盐突变体。实验取得如下进展: 1.油菜小孢子培养体系摸索:相同基因型在不同生态条件下种植,出胚率差异很大,青海西宁夏播种植的材料出胚率显著高于湖北武汉秋播种植的材料；不同基因型间小孢子产胚率有显著差异;大田条件下初花期接种的小孢子产胚率高于盛花期,部分基因型盛花期取样的小孢子完全不出胚；不同基因型小孢子再生苗的自然加倍率也有差异,变异幅度为8.62％～20.83％;对11个不同基因型材料分离出的小孢子分别处以2d和3d热激处理,32℃热激3d较适合于大部分供试材料小孢子的胚胎发生；低温预处理花蕾可以提高小孢子出胚率,但是不同基因型材料对预处理时间要求不同；0.162 mg／L多效唑可以显著壮苗,提高了移栽成活率,并有效地延长试管苗在三角瓶中的保存时间；小孢子组培苗通过温室炼苗15d之后移栽到大田平均成活率可以达到93.82％,比未经温室炼苗直接移栽高7.55％。 2.流式细胞仪早期鉴定小孢子再生植株倍性:流式细胞仪测定细胞核DNA含量以鉴定小孢子再生植株倍性,结果与田间形态鉴定结果一致,因此该技术可以作为一种简便有效的手段用于小孢子植株的早期鉴定。 3.小孢子染色体加倍:小孢子植株自然加倍率仅8.62～20.88％。50mg／L秋水仙碱处理小孢子可以显著增加小孢子再生苗的二倍体(2n=4x)数量,加倍率比未处理的最高可提高3倍以上。材料R1×R2经过1g／L秋水仙碱处理8h浸根加倍,加倍率达到78.03％。 4.小孢子辐射诱变条件:基因型是影响紫外线小孢子LD50的一个重要因素,同时随着辐射时间的延长,小孢子的出胚率逐渐下降。但是不同基因型材料的小孢子对紫外线的反应敏感度有所不同,材料R2在100s时达到LD50,R6在120s达到LD50,C203在170s时达到LD50,而中双11号和川2121超过240s达到LD50,8908B在300s时达到LD50。紫外线不仅影响小孢子的出胚率,还影响小孢子胚的出苗率。小孢子出胚率的LD50剂量下,出苗率也可以达到较高水平,可以作为最适诱变条件。 5.耐盐突变植株筛选:将小孢子再生植株茎尖剪下接种至含有340mM NaCl的筛选培养基中,经过两次筛选,从1356株材料中初步筛选出5株耐盐性强的植株,这5株材料需要田间进一步验证耐盐能力。
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